高压氧联合抗震颗粒与美多芭对实验性帕金森病大鼠黑质bcl-2、bax表达的影响

高压氧联合抗震颗粒与美多芭对实验性帕金森病大鼠黑质bcl-2、bax表达的影响

帕金森病的病因尚不清楚，这是一种慢性进展缓慢的中枢神经系统退行性疾病。到目前为止，没有一种绝对有效的治疗方法和药物可以治愈这种疾病，也没有阻止病史发展的基本方法。2009年10月至2010年6月我们对比观察了高压氧联合抗震颗粒与临床上治疗帕金森病的“金标准”药物——美多芭对帕金森病模型大鼠黑质Bcl-2、Bax基因表达的影响,旨在寻求有效的神经保护性治疗措施,为高压氧结合抗震颗粒治疗帕金森病提供理论及实验依据,现报告如下。1材料和方法1.1体质量、鼠龄健康雄性Wistar大鼠40只,SPF级,由广西医科大学医学实验动物中心提供(SCXK桂2009-0002),体质量(260±10)g,鼠龄12～15周。饲养条件:室温(25±5)℃,湿度(60±20)%,饲以实验动物中心提供的饲料(成分有大米粉、玉米粉、鱼粉、奶粉、麦麸、多维素、鱼肝油、鸡蛋以及盐等)。自由摄食、饮水。1.2主要试剂和仪器美多芭(上海罗氏制药有限公司,国药准字H10930198),每片250mg。抗震颗粒由本实验室自行提取(原药材由江苏天阴制药厂提供),成分为熟地黄12.0g、山药0.6g、山萸肉2.5g、枸杞子12.0g、菟丝子0.6g、牛膝3.0g、白芍药2.5g、甘草1.5g、珍珠母0.5g、党参4.5g、制何首乌1.5g、肉苁蓉3.0g、补骨脂1.5g、益智仁1.5g、丹参3.0g、全蝎粉0.5g、粉葛根3.0g、鹿角胶10.0g、龟版胶30.0g,按照既定工艺煮成汤药,浓度为0.5g/ml的混悬液供灌胃用。6-羟基多巴胺(6-OHDA,美国Sigma公司,批号MKAA4439)。兔抗-Bax(批号:H0709)、兔抗-Bcl-2(批号:L0409)、DAB显色试剂盒均为北京中杉金桥生物技术有限公司产品。PBS(国药集团化学试剂有限公司)。主要仪器:03-Y900-001型动物氧舱(烟台宏远氧业有限公司);LeicaRw2335轮转切片机(德国);CX41奥林巴斯生物显微镜(德国);PMR+Q550病理图像分析仪(德国)等。1.3学习方法1.3.1给药、大鼠及美多升通过向大鼠右侧中脑腹侧被盖区单点注射6-OHDA的方法成功建立偏侧帕金森病大鼠模型,将制模成功的18只大鼠按照随机数字表法随机分为模型组、美多芭组及高压氧联合抗震颗粒组各6只。模型组每鼠给予生理盐水2ml·100g-1·d-1灌胃;美多芭组每鼠给予美多芭10mg·kg-1·d-1灌胃;HBO联合抗震颗粒组每鼠灌胃抗震颗粒10.0g生药·kg-1·d-1,同时给予高压氧治疗:动物进舱,先用纯氧洗舱10min,按100kPa/min速率加压至0.25MPa,在高压下停留60min,动物吸舱内氧气,然后以10min匀速减压至常压,动物出舱,让其自由摄食、饮水。3组均1次/d,共治疗14d。1.3.2免疫组织化学法检测石蜡切片的制备取各组大鼠深度麻醉后仰卧固定,快速开胸暴露心脏,直视下将穿刺针经左心室刺入升主动脉,先用37℃生理盐水250ml快速冲洗,再灌注4%PBS(0.1mmol,pH7.4)250ml,先快后慢,全灌注时间1h;然后开颅分离出黑质置于4%PBS液中固定、脱水、石蜡包埋备用。将石蜡包块进行超薄切片,参照免疫组织化学法分别进行Bcl-2和Bax染色:石蜡切片常规脱蜡水化;后根据每一种抗体的要求,对组织抗原进行相应修复;加入过氧化酶阻断溶液(过氧化氢∶甲醇=1∶9)室温下孵育15min,以阻断内源性过氧化物酶的活性,PBS液冲洗3次;除去PBS液,正常非免疫动物血清封闭10min;除去血清,滴加第一抗体,室温下孵育2～4h,PBS液冲洗3次;除去PBS液,滴加第二抗体,室温下孵育10min,PBS液冲洗3次;除去PBS液,然后滴加新鲜配制的DAB溶液,显色3～5min;自来水冲洗,苏木素复染,再用自来水冲洗返蓝;最后自然干燥,中性树脂封片,镜下观察切片。免疫组化染色Bcl-2和Bax阳性信号为棕黄色或棕褐色,阳性表达定位于细胞质,细胞核蓝染不表达,采用半定量计数法在病理图像分析仪下观察各张玻片,在每张玻片上,分别随机选择10个区域,每个区域计数100个细胞,然后加在一起统计出每千个黑质细胞中Bcl-2和Bax凋亡蛋白阳性表达的细胞数,即黑质Bcl-2、Bax阳性神经元的细胞千分率(‰)。1.4统计方法采用SPSS13.0统计软件进行统计。计量资料以x±s表示,多组均数比较采用单因素方差分析,以P<0.05为差异有统计学意义。2结果2.1高压氧联合抗震颗粒及美多升级蛋白表达水平对bcl-2表达的影响治疗后各组大鼠Bcl-2、Bax蛋白阳性表达率比较差异有统计学意义(P均<0.05),高压氧联合抗震颗粒组及美多芭组Bcl-2蛋白阳性表达率明显高于模型组(P<0.05),Bax蛋白阳性表达明显低于模型组(P<0.05),见表1。2.2异常行为改善高压氧联合抗震颗粒组帕金森病大鼠震颤、头偏斜、行动迟缓、易激惹、尾僵直等异常行为有不同程度改善。美多芭组大鼠震颤、竖毛、嗅探、易激惹等异常行为亦有不同程度改善。3补泻虾、养肝药成分及作用机制帕金森病是常见的神经系统退行性疾病之一,主要发生于中老年人,40岁前发病十分少见。病因仍不完全清楚,可能与遗传、氧化应激和线粒体功能缺陷、环境因素、兴奋性毒性作用、免疫因素及细胞凋亡等有关。目前,左旋多巴制剂仍然是公认的治疗帕金森病最基本、最有效的一线药物,具有起效快、减轻症状明显等优点。我们研究所用之美多芭为复方制剂,每片含左旋多巴200mg、盐酸卞丝肼50mg(以卞丝肼计)。左旋多巴为体内合成去甲肾上腺素、多巴胺的前体,卞丝肼为外周多巴脱羟酶抑制剂。左旋多巴与卞丝肼按4∶1配伍为美多芭应用,可减少左旋多巴的用量,增强其疗效并减少其外周不良反应。帕金森病属于中医学颤证、震颤等范畴。肝肾阴虚、气血不足是帕金森病发病的最根本原因,气滞血瘀、痰热动风是帕金森病发病的重要因素,针对这一病机特点,故认为滋肾平肝,活血化瘀,涤痰散结三法综合运用应该是其治疗法则。抗震颗粒便是以此原则组方,由补肝肾的经典代表方左归丸加味组成,方中以熟地黄补肾益精、滋阴养血;山药、党参健脾益气;珍珠母定惊止颤、养血舒筋;白芍滋肝阴;山萸肉、枸杞滋补肝肾;肉苁蓉益肾填精;丹参活血通经;粉葛根疏通经络;全蝎熄风祛瘀;龟版胶、鹿角胶合用,益精填髓等,共奏虚实并治,标本兼顾之功效。我们在实验研究中发现,高压氧联合抗震颗粒能明显抑制黑质神经元细胞凋亡,对帕金森病大鼠有保护性治疗作用。高压氧可能通过提高血氧分压,氧弥散进入缺氧脑区的能力增强,使脑组织氧含量增加,有效改善脑组织的缺氧状态,使变性的黑质和黑质纹状体通路神经纤维功能得以恢复,从而使多巴胺的生成和运输功能改善;兴奋交感-肾上腺髓质系统,使肾上腺-多巴胺分泌增加,从而改善患者活动能力、步态,而且对面部表情、震颤有一定疗效;高压氧对自由基的清除作用已被证实,它可提高超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽的含量,加强清除自由基和抗氧化的能力,减轻自由基对脑组织的损害;增强线粒体三磷腺苷(ATP)酶活性,加速电子传递过程,使ATP产生增加,恢复大脑神经元的能量供应,增强血-脑脊液屏障通透性,加速抗震颗粒通过血脑屏障,提高抗震颗粒的生物活性,因此增强抗震颗粒的药效等来达到治疗帕金森病的目的。因此高压氧联合抗震颗粒在一定程度上能延缓黑质多巴胺神经元进行性蜕变及病情进展,改善其临床症状。细胞凋亡是相对细胞坏死而言的另一种细胞死亡方式。细胞内存在两种功能相反的与凋亡相关的基因:抗凋亡基因(Bcl-2、Bcl-XL等)和促凋亡基因(Bax、Bcl-XS等),它们之间的动态平衡保证着细胞的正常生长。Bcl-2/Bax比率的高低可能决定细胞趋向生存或死亡。Bcl-2基因编码的Bcl-2是一种膜定位蛋白,具有抑制多种细胞发生凋亡的作用,其基因表达的增加有减少黑质多巴胺神经元凋亡的作用。Bax蛋白是黑质细胞凋亡的关键启动因素,其增加就能增加黑质多巴胺神经元凋亡。本研究中高压氧联合抗震颗粒组及美多芭组Bcl-2阳性表达率明显高于模型组(P<0.05),表明高压氧联合抗震颗粒及美多芭均能使Bcl-2表达增加,从而抑制黑质多巴胺神经元凋亡;两组Bax阳性表达率明显低于模型组(P<0.05),提示高压氧联合抗震颗粒及美多芭早期应用均能在一定程度上抑制帕金森病模型大鼠中脑黑质内Bax蛋白的表达,从而发挥抑制细胞凋亡的作用。高压氧联合抗震颗粒组与美多芭组Bcl-2及Bax阳性表达率比较差异均无统计学意义(P>0.05),说明高压氧联合抗震颗粒与美多芭均发挥抗凋亡治疗作用。在研究中还发现,高压氧联合抗震颗粒组及美多芭组大鼠治疗后震颤、活动迟缓、易激惹、竖毛、尾僵直等帕金森病异常行为均有不同程度的改善。尽管多数研究表明,应用左旋多巴制剂可能导致神经细胞凋亡,产生神经毒性,从而加速帕金森病的神经变性过程,长期使用,其药效会降低,并且出现严重的副作用。但由于本研究的动物实验中应用美多芭时间较短(14d),长