药物致兔视网膜上皮细胞损伤的实验研究

药物致兔视网膜上皮细胞损伤的实验研究

现代光学治疗方法包括对光学药物的药物治疗、皮肤科的治疗、手术的治疗和视觉功能的治疗。目前大部分临床医生对原发性开角型青光眼尤其是早期患者仍选择药物为首选治疗方法,而高眼压症患者、开角型和闭角型青光眼不能或不愿行激光或手术治疗者则需终生使用青光眼药物以控制眼压。长期使用青光眼药物后,药物本身及眼药中添加的防腐剂将不可避免地对患者的眼表结构(泪膜、结膜、角膜上皮)产生影响,引起泪膜功能破坏、球结膜亚临床炎症、球结膜和角膜上皮细胞的损伤,导致患者眼部不适、长期用药依从性降低、甚至干眼的发生。此外,当部分患者由于药物治疗后眼压控制不良而行滤过手术治疗时,眼表结构的变化可能促进滤过道的瘢痕化,导致滤过手术的失败。目前国外已开展抗青光眼药物对眼表毒性的研究,国内对我国常用的抗青光眼药物眼表毒性作用的相关报道较少。并且,国内外临床医师应用一线青光眼药物种类有所差异,药物中添加的防腐剂种类也有所不同。例如,国外进行眼表毒性研究最多的是前列腺素类药物,因价格昂贵,目前还未能成为国内的主要抗青光眼用药。而作为最古老的抗青光眼药物之一的毛果芸香碱,由于它使用后引起的调节痉挛、视物模糊、视网膜脱离等副作用,在国外已不属于最主要的青光眼用药;但因其价格低廉,制备工艺成熟,在我国许多基层医院仍在广泛使用。国外眼药中最常用的防腐剂是氯化苯甲烃胺(benzalkoniumchloride,BAC),但该防腐剂在国产眼药中使用较少,国内常用的防腐剂种类包括硫柳汞、三氯叔丁醇、洗必泰及新洁尔灭等。因此,为探讨目前临床上常用的国产青光眼药物与进口青光眼药物对眼表影响的区别、国内外常用防腐剂对眼表的影响的不同,我们选用毛果芸香碱滴眼液(1%pilocarpine,国产)和布林佐胺滴眼液(1%brinzolamide,进口)以及各自添加的防腐剂进行动物实验,以评价它们对结膜和角膜等眼表结构的影响及差异。材料和方法1氯县丁醇酯、前光醇酯及其他alcon本研究中使用的1%毛果芸香碱滴眼液(1%pilocarpine,粤药制字H03020639,批号060817)由中山大学中山眼科中心制备,所含防腐剂为0.01%三氯叔丁醇;1%布林佐胺滴眼液(1%brinzolamide,批号06D26I)由Alcon生产,所含防腐剂为0.01%BAC。防腐剂溶液0.01%三氯叔丁醇和0.01%BAC由中山眼科中心药剂室配制。2眼底药物使用组选用新西兰大白兔15只,体重1.5-2.0kg,雌雄兼用。常规裂隙灯显微镜检查排除眼部疾病。随机选择3只兔列入空白对照组,其余12只兔随机分为2组,列入药物组,每组6只兔,命名为毛果芸香碱组(A组)和布林佐胺组(B组)。右眼使用青光眼药物,归为1组;左眼使用防腐剂,归为2组。3方法3.1连续给药时间及用药时间参考目前临床上青光眼患者的用药方法,毛果芸香碱和对应的防腐剂三氯叔丁醇每天滴眼4次(用药时间:上午8点、中午12点、下午4点、晚上8点),布林佐胺及防腐剂BAC每日滴眼2次,用药时间为上午8点和晚上8点,均连续用药30d。3.2球薄膜的固定新西兰大白兔用药30d后,经耳缘静脉空气栓塞处死。为了减少取材偏差,每只兔的球结膜组织均取自上方12点钟,自角膜缘至角膜缘后约6mm剪取上方的球结膜,迅速置于4%多聚甲醛中固定,4℃保存,固定时间24h。沿角膜缘剪取全周角膜,用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗,表面干净后立即置于3%戊二醛中固定,4℃保存,固定时间4h。3.3细胞浆和细胞核的染色结膜在4%多聚甲醛中固定24h后,用60%、70%、80%、90%及无水乙醇梯度脱水,石蜡包埋,连续切片,厚5μm。行苏木素-伊红(HE)染色:石蜡切片脱蜡至水,苏木素溶液染色3min,自来水充分水洗、显蓝;1%盐酸乙醇分化数秒,洗涤;伊红复染3min后,梯度乙醇脱水,二甲苯透明,中性树胶封固后置于光学显微镜下观察。染色结果显示为细胞浆呈红色,细胞核呈蓝色。于高倍镜下(×40)进行上皮层炎症细胞计数,任意计数3个高倍视野后取平均值。3.4去蛋白镜分级角膜组织在戊二醛中固定后,用0.1mol/LPBS冲洗3次,每次10min。用30%、50%、70%、90%及无水乙醇逐级梯度脱水,醋酸异戊酯置换。临界点干燥,用离子溅射镀膜仪于标本表面喷镀金属导电层后,由一位观察者用扫描电镜(SEM,PhilipXL-30)进行观察评分。每1个角膜标本均任意选取距离角膜顶点2mm的3个观察点,在3000倍和6000倍下观察角膜上皮细胞微绒毛有无丢失、细胞膜有无皱缩、上皮细胞表面的空洞数量、上皮细胞的形态、细胞交界边缘、暗细胞数量以及上皮细胞有无丢失等。根据Berdy等的角膜上皮损害的扫描电镜分级标准进行分级,设0-5级,0级表示无损害,5级表示严重损害。0级:无微绒毛的破坏和细胞膜皱缩,无上皮细胞剥脱,细胞空洞数量正常;1级:微绒毛轻度受损,发生细胞膜皱缩的细胞数少于上皮细胞总量的10%,上皮细胞剥脱数<2%,细胞空洞增加,暗细胞增加;2级:微绒毛中度弥漫受损,发生细胞膜皱缩的细胞数介于上皮细胞总量的10%-50%,上皮细胞剥脱数占细胞总量2%-25%,上皮细胞的六边形结构发生改变;3级:发生细胞膜皱缩的细胞数超过上皮细胞总量50%,弥漫性的上皮细胞剥脱,超过上皮细胞总量25%,细胞间的间距增宽;4级:表层上皮细胞完全丢失,第2层细胞层完整;5级:在4级的基础上发生第2层细胞丢失。4统计学分析数据采用SPSS12.0统计分析软件进行分析。计量资料以均数±标准差(x¯±s)(x¯±s)表示;采用Mann-WitneyU检验进行各个独立组间的统计学分析;Wilcoxon检验进行左右两眼之间炎症细胞计数和角膜上皮评分的统计学分析。结果1球结膜组织光度检查1.1上皮细胞的排列正常对照组兔眼球结膜组织常规石蜡切片光镜下检查可见:上皮细胞排列整齐,杯状细胞数量正常,上皮基底膜完整;上皮下胶原组织疏松;无明显的急性或慢性炎症表现,仅见少量散在的炎症细胞,见图1A。1.2治疗前后球结晶上皮质炎症细胞数毛果芸香碱组(A1、A2组)兔球结膜光镜检查结果与对照组相比,球结膜上皮层炎症细胞增多不明显;而布林佐胺组(B1、B2组)的上皮层炎症细胞数较正常对照组显著增多(表1、图1B-E)。A1组和B1组(Z=-2.923,P<0.01)、A2和B2组(Z=-2.898,P<0.01)之间球结膜上皮层炎症细胞数均差异显著。同时,为分析青光眼药物与防腐剂各自在对眼表的影响中的作用,我们对两组左右两眼的炎症细胞数进行了对比分析。结果显示A1组与A2组(Z=-0.674,P>0.05)、B1组与B2组(Z=-0.105,P>0.05)之间球结膜上皮层炎症细胞数均无显著差异。2综合扫描电镜检查结果2.1视网膜微绒毛细胞正常对照组兔角膜上皮组织扫描电镜观察可见:角膜上皮细胞呈多边形,边界清晰、排列整齐,细胞膜无皱缩,细胞表面微绒毛丰富,细胞空洞和暗细胞数量少、几乎不可见,见图2A。2.2布林佐胺对兔视网膜组织形态变化的影响毛果芸香碱组兔角膜上皮细胞的细胞形态无明显变化,呈规则的多边形,边界清晰,细胞膜皱缩不明显;但上皮细胞表面的细胞空洞增加,可见散在分布的暗细胞,微绒毛轻度丢失,见图2B。单纯使用三氯叔丁醇后兔角膜上皮组织的形态与使用毛果芸香碱后的角膜上皮组织的形态变化无明显差别,见图2C。布林佐胺组兔角膜上皮细胞的细胞膜皱缩、细胞间隙增宽,细胞交界处边界模糊;上皮细胞表面微绒毛丢失较严重,细胞空洞和暗细胞数量显著增加,甚至部分上皮细胞剥脱丢失,见图2D。单纯使用0.01%BAC也可引起类似的角膜上皮损害,见图2E。根据角膜上皮损害分级标准,正常对照组角膜上皮评分为0.50±0.55,A1组为1.33±0.52,A2组为1.50±0.55,B1组为2.83±0.68,B2组为2.75±0.76,各组的损害评分均显著高于对照组(表2)。B1组(Z=-2.802,P<0.01)、B2组(Z=-2.514,P<0.05)的损害评分分别较A1组、A2组的损害评分显著增高;A1组与A2组(Z=-1.000,P>0.05)、B1组与B2组(Z=-0.378,P>0.05)损害评分无统计学差异。球从药物的作用国外针对局部应用青光眼药物对眼表的毒副作用已进行了体外细胞实验和动物实验,但是国外的研究结果并不完全适用于国内的用药情况。国内外的一线青光眼药物选择存在差别,国外对眼表毒副作用研究最多的前列腺素类药物,如拉坦前列腺素、曲伏前列素、贝美前列素等。然而由于此类药物价格昂贵,在国内还未能向大部分患者推广使用。毛果芸香碱是最古老的抗青光眼药物之一,自19世纪使用至今,在青光眼的治疗中起了重要作用。但由于使用后会引起调节痉挛、视物变暗、眉弓疼痛等副作用,高浓度频繁滴眼还可能导致胃肠道反应、头痛、出汗等全身中毒症状,因此随着新的抗青光眼药物的研发成功,在国外它已不属于一线青光眼用药。然而,在我国尤其在许多基层医院仍是占主导地位的青光眼药物。且我国的闭角型青光眼的发病率明显高于西方国家,对一部分不能或不愿行激光或手术治疗的患者或者激光治疗后需要联合药物治疗的患者,毛果芸香碱因其能够使瞳孔括约肌收缩的药理作用而具有其它青光眼药物不可替代的地位。毛果芸香碱可以使瞳孔括约肌收缩,减少虹膜组织在房角的堆积从而开放房角,使房水流经小梁网进入Schlemm管而降低眼内压,对闭角型青光眼的治疗效果较好。碳酸酐酶抑制剂是另一类十分重要的抗青光眼药物,传统剂型是以乙酰唑胺为代表的口服制剂,可以抑制房水生成,降低眼压,但长期服用会导致指趾麻木、肾绞痛、血尿等全身副作用,因此,限制了它的临床应用。布林佐安滴眼液是新型的局部碳酸酐酶抑制剂,在有效降低眼压的同时不会引起明显的全身毒副作用,因此研发上市后已较广泛运用于临床。球结膜的健康状况与青光眼用药的舒适度密切相关,球结膜炎症引起的眼部不适和刺激症状将影响青光眼患者长期用药的依从性;同时,球结膜的炎症和纤维化程度也将直接影响青光眼滤过手术的成功率,因此,球结膜的情况一直很受治疗青光眼医生的重视。我们的研究结果表明在使用青光眼药物和防腐剂30d后,毛果芸香碱组的兔球结膜组织的上皮层炎症细胞与对照组无明显差异,而布林佐胺滴眼液和BAC导致球结膜上皮层炎症细胞显著增多。参考目前临床上青光眼患者的用药方法,在本研究中尽管毛果芸香碱滴眼液和防腐剂三氯叔丁醇每日点药4次,而布林佐胺滴眼液和BAC仅点药2次,但它们对球结膜组织的副作用仍轻于布林佐胺滴眼液和BAC。究其原因,由于左右两眼之间的球结膜炎症并无显著差异,我们推测防腐剂在球结膜炎症的发生过程中起主要作用。Debbasch等选择Chang结膜细胞进行青光眼药物各种防腐剂的毒性研究,发现三氯叔丁醇对结膜上皮细胞的毒性很低,BAC与三氯叔丁醇、硫柳汞相比,则是毒性最强的一类防腐剂。BAC对结膜细胞的毒性作用呈剂量依赖性,在较低浓度(≤0.005%)范围时,BAC浓度越高对结膜上皮细胞的毒性作用越明显,可引起细胞的凋亡;而短期、高浓度使用BAC,将直接导致细胞坏死。Baudouin等推测防腐剂成份首先引起球结膜细胞分泌的炎症介质增多(如IFN-γ、血小板激活因子等),炎症介质诱导HLA-DR抗原和CD-23的表达,从而进一步引起球结膜细胞群的变化和炎症的产生。鉴于毛果芸香碱滴眼液对球结膜的损害轻于布林佐胺滴眼液,尽管毛果芸香碱滴用后存在一些副作用,但对已经存在球结膜慢性炎症或者干眼的患者,如果不存在药物使用禁忌症,从对眼表毒性的角度考虑,毛果芸香碱滴眼液优于布林佐胺滴眼液。扫描电镜检测显示青光眼药物和防腐剂均会导致兔角膜上皮超微结构的损伤,表现为角膜上皮细胞六边形结构变为不规则、边界不清、细胞膜皱缩、细胞间距增宽、上皮细胞表面的微绒毛丢失、细胞空洞和暗细胞增加等。布林佐胺滴眼液和BAC对角膜上皮细胞的损伤显著重于毛果芸香碱滴眼液和三氯叔丁醇。Noecker等为探讨青光眼药物对角膜的影响,曾对新西兰大白兔使用酒石酸溴莫尼定、噻吗心胺、拉坦前列腺素等青光眼药物并进行角膜扫描电镜检测,结果表明这些药物均会导致角膜上皮超微结构的损伤,也表现为微绒毛丢失、上皮细胞空洞增多和暗细胞增多等,角膜暗细胞的性质可能是凋亡的角膜上皮细胞。由于左右两眼的角膜上皮细胞的损害并无显著差异,我们分析防腐剂是导致角膜上皮细胞损害的主要因素。三氯叔丁醇属于丙酮的氯衍生物,虽然对角膜上皮细胞有直接的细胞毒性,但毒性较轻、且可逆。BAC是一种四价氨化合物,可以嵌入细胞膜改变细胞膜的离子电阻而导致细胞膜通透性增加。体外细胞实验中BAC对角膜细胞的毒性作用也呈剂量依赖性,在较低浓度(≤0.005%)范围时,引起细胞的凋亡;而短期、高浓度使用BAC,将直接导致细胞坏死。同时,由