马铃薯茎尖诱导与壮苗技术研究

马铃薯茎尖诱导与壮苗技术研究

在种植过程中，甘薯容易感染病毒。病毒会随着持续积累而积累，这很容易导致种性退化、产量和品质下降。通过诏书尖脱毒和鉴定病因，我们不仅可以在短时间内获得大量无病毒苗，而且保持品种的良好特性。通过这项工作，甘薯尖脱毒训练的难度主要与茎尖大小、培养基、培训条件和病毒类型有关。这项工作的内容主要是对甘薯茎尖进行剥离和培养，并使用双重免疫吸痰法（das-elisa）对病毒检测进行脱毒苗。进一步提高甘薯茎尖培训的成活率和脱毒率。1材料和方法1.1茎尖脱毒活性测定供试材料为田间长势良好无病症表现的大西洋、费乌瑞它2个品种的植株,收获后将薯块置于室内2~3周后,经检测用不带有马铃薯纺锤块茎类病毒的块茎进行催芽,放入35~37℃恒温箱中进行热处理1个月后,用解剖刀从薯块切取长1cm左右的芽置于流水中冲洗1~2h,然后置于超净工作台灭菌,用75%的酒精浸泡30s,再用10%的次氯酸钠灭菌6~8min,然后在40倍的显微镜下用解剖刀与解剖针剥取带2个叶原基(直径约为0.2~0.5mm)的茎尖置于培养基中培养.以MS作为基本培养基并附加一定浓度6-BA和NAA的培养基上培养3~5个月长出小芽后,转入MS培养基进行继代培养.马铃薯病毒检测采用酶联免疫检测法(DSA-ELISA),主要检测马铃薯卷叶病毒(PLRV)、马铃薯A病毒(PVA)、马铃薯Y病毒(PVY)、马铃薯M病毒(PVM)、马铃薯X病毒(PVX)、马铃薯S病毒(PVS).茎尖脱毒的统计标准为:对茎尖培养成活的植株,经DSA-ELISA检测,马铃薯卷叶病毒、A病毒、Y病毒、M病毒、X病毒、S病毒均呈阴性.1.2试验设计1.2.1ms培养实验结果设计不同浓度6-BA、NAA与GA3的组合,研究激素对茎尖成活率的影响.每个设计组合接种40个直径为0.2mm带1~2个叶原基的茎尖,以MS为基本培养基,培养温度为25℃,光照强度为2000lx,光照时间为8h,待芽点转绿后转入MS继代培养中,4个月后统计实验结果(表1).1.2.2茎尖成活率测定以大西洋和费乌瑞它的块茎芽为材料,在显微镜下分别挑取带1个叶原基、2个叶原基、3个叶原基的茎尖,接种于MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L培养基中,每个处理接种40个茎尖,120d后统计实验结果.待芽点变绿后转入MS培养基中继续培养成苗,统计成活率与检测脱毒率.茎尖成活率的统计方法参照盖琼辉等的方法.1.2.3马铃薯复壮的最佳浓度本实验设计同一浓度IBA与不同浓度B9相组合,寻求B9对马铃薯试管苗复壮的最佳浓度.以大西洋为材料,在无菌条件下,将试管苗剪成约2cm长带有1~2张叶片的茎段,接种到以下继代培养基中培养,20d后统计实验结果(表2).2结果与分析2.1不同浓度的6-ba、naa、ga3对叶原基茎尖生长的影响茎尖成活的关键因素是茎尖的大小,且同一大小的茎尖其成活率与培养激素的浓度有关.实验结果表明:以直径为0.2mm带1~2个叶原基的茎尖在MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L+GA30.02mg/L培养基里成活率最高,达50%.说明较低浓度的6-BA、NAA与GA3组合有利于茎尖的生长,但随着6-BA与GA3浓度的增加,茎尖玻璃化严重,甚至死亡(表3).2.2茎尖的成活率和脱毒率茎尖的大小对茎尖成活率与脱毒率有一定的影响,从表4可以看到,当茎尖越大时,成活率就越高,但是脱毒率也就越低;反之,茎尖越小,越难于成活,但脱毒率会越高.因为茎尖病毒积累较少,切取的部位越小,带病毒就越少,脱毒率就越高,但操作的难度也随之而增大,成活率也会下降.实验方法主要是对茎尖培养成活的植株进行成活率统计,并对培养成活的植株进行病毒检测,测定植株的脱毒效果.结果表明:以直径大小为0.2mm带1~2个叶原基的茎尖为外植体进行培养,其成活率与脱毒率较高,分别为68%和56%(表4).2.3不同浓度b9对马铃薯植株生长的影响不同浓度的B9与同一浓度的IBA相结合对马铃薯试管苗复壮效果如表5所示.当B9浓度为5mg/L时,与对照植株相比,无明显差别;但随着B9浓度升高,马铃薯叶色加深,呈浓绿色,同时叶片增大,茎增粗,植株矮化明显.当B9浓度达到20mg/L时,植株虽然较为粗壮,但是叶片稍微有些玻璃化.由此可见,B9在一定的浓度范围内对马铃薯植株矮化和壮苗有一定作用,但是随着浓度的增高,对植株生长表现出一定的抑制作用.因此,从实验结果来看,B9的浓度为15mg/L时,对植株的长势最好.3讨论3.1茎尖的培养由于马铃薯的脱毒培养技术要求较高,因此影响茎尖成活的因素也较多,一是茎尖的大小.掌握茎尖的大小是脱毒与成活的关键因素.一般而言,茎尖越大成活率越高,茎尖越小死亡率越高;但是茎尖越大脱毒效果也就越差,茎尖越小脱毒效果也就越好.因此,掌握好茎尖的大小是个关键的因素.本实验结果表明以直径大小为0.2mm带1~2个叶原基的茎尖为外植体进行培养,其成活率较高,为68%.但是挑取的茎尖必须带有叶原基,这样既保证了成活率同时也保证一定的脱毒率.二是培养基中的激素浓度.附加一定种类与浓度的生长激素对于茎尖的生长有一定的促进作用,但是由于挑取的茎尖较小,激素浓度若太高则易引起玻璃化而死亡,因此掌握激素的浓度也是非常关键的.本实验用0.5mg/L浓度的细胞分裂素6-BA与0.1mg/L浓度的生长素NAA相结合对茎尖培养的成活率较好.三是培养的条件.茎尖培养的适宜条件为温度22~25℃,光照时间为8h,环境的温度过高或过低都不利于茎尖的生长.3.2植物生长减缓剂的使用采用不同的措施可以使马铃薯试管苗达到壮苗目的,使其茎杆变粗,叶片变浓绿,根系变粗.关于这方面的研究报道很多,有直接用1/2MS或用简化培养基代替MS培养基,有用自然光代替日光灯等,以及在培养基中添加矮壮素或植物生长延缓剂B9.B9主要是抵制植物体内源激素GA的合成,对调节试管苗生长、促进壮苗都有重要作用,同时还抑制试管苗顶端优势,缩短节间距离,促进腋芽的发育,从而有效提高繁殖系数.本实验结果与前人研究结果相符,在附加IBA激素的培养基上添加一定浓度的B9有利于马铃薯植株矮壮,茎杆增粗,叶片变浓,根系增粗.当B9使用浓度为15mg/L时,植株长势最好.3.3马铃薯病毒检测方法一般在马铃薯病毒检测中的应用植物病毒诊断的方法有很多种:根据被侵染植株表现的症状进行诊断,指示植物法,电子显微镜观察法,核酸斑点杂交,PCR或RT-PCR法以及血清学检测法等等.其中血清学检测是目前最常用的快速有效的病毒检测方法.双抗体夹心酶联免疫吸附测定法(DAS-ELISA)在马铃薯病毒检测中应用较广,其方法操作简单,检测时间短,结果也较为准确可靠.但是由于使用进口的血清价格较为昂贵,成本较高,普及程度有限;再者由于操作不当也会引起假阳性的情况出现,从而影响结果的准确性.因此,在采用DAS-ELISA测定法的同时,应结合相应的生物测定法,以保证结果的准确性与可靠性.3.4马铃薯茎尖的脱毒率影响茎尖脱毒的关键因素主要有2个:一是病毒的种类;二是剥离茎尖的大小.不同种类的病毒脱除的难易程度不一,马铃薯病毒脱除的难易顺序为:马铃薯卷叶病毒(PLRV)、马铃薯A病毒(PVA)、马铃薯Y病毒(PVY)、马铃薯M病毒(PVM)、马铃薯X病毒(PVX)、马铃薯S病毒(PVS)和马铃薯纺锤块茎类病毒(PSTV).茎尖培养虽然可以脱除马铃薯的病原菌,但脱毒率仍然很低.因此,可根据病毒和植物细胞对热处理温度与时间的反映,结合热处理(3