七个步骤教你通过反应曲线排查生化仪系统误差

七个步骤教你通过反应曲线排查生化仪系统误差目前生化检验工作中自动化分析仪的应用十分普遍，自动化分析取代了费时费力的手工操作，既提高了工作效率又便于生化检验标准化，大大推动了生化检测的发展。生化反应曲线分析是每一个使用全自动生化仪的检验人员都应该必备的技能，通过反应曲线可快速有效地查找分析生化检测中误差、失控产生的原因，可帮助发现隐匿型失控如超出线性范围，然后有针对性地找到解决问题的方法，从而保证检验结果的准确、有效。下图是一个动力学零级反应双试剂的正常反应曲线（以GGT的一个正常曲线为例），今天我们就通过这个例子和大家共同学习一下全自动生化分析仪的反应曲线：图1.动力学法零级反应（动态监测法）双试剂的反应曲线反应曲线概述反应曲线的纵坐标为吸光度，注意这里的数值是真正的吸光度乘以10000,上图中吸光度为100的实际吸光度应该是0.01A。反应曲线的纵坐标间隔，不同厂家的试剂和生化项目上都是不固定的，所以仅仅从反应曲线我们无法确认吸光度的波动是否超限，必须配合上相应的反应数据才能进行确认。反应曲线的横坐标为测量周期，根据参数有不同测量周期一般为8-12秒。不同反应阶段我们把一个正常的双试剂反应曲线可以认为地分为6个部分，如图中所示：A点加入试剂1（RI）;B段RI升温；C点加入样本（S）;D段S+Rl孵育时间；E点加入R2（试剂2）；F段反应开始直到结束。单试剂的测试与双试剂相比只是少了D、E两步。A点加人试剂1反应曲线测试周期为0的一点为杯空白，在A点即第1个测试周期，试剂l加入反应杯中，这一点的吸光度应该为试剂1的试剂空白。这一点和杯空白不同，所以第一点是杯空白，第二点是试剂空白。针对不同的试剂，A点的吸光度会有不同，我们要认真阅读试剂说明书。例如ALT的第一试剂中含有主要的吸光物质NADH，而试剂说明书中对试剂空白的要求是必须大于1.0,这就决定了A点的吸光度在图中的纵轴应该在10000以上，常见的应该在17000到20000之间；而Y—GT的第一试剂中并不含任何主要的吸光物质，试剂说明书当中对试剂空白的要求是小于1.3。如果一旦出现吸光度不满足试剂的性能要求，可以考虑试剂失效（请丢弃）；另一方面，大部分设备的吸光度检测范围都不超过2.5，因为生化仪的检测原理为Lambert-Beer定律，它只适合于均匀非散射的低浓度介质，一般比色法测量值推荐的吸光范围在0.3-0.7以内，如果A点的吸光度达到了50000以上（唯一例外的是CO2的试剂要求是不小于1.2A），要考虑是否有可能在反应杯中出现了污染物或者气泡，此时取出相应的反应杯进行肉眼观察是最好的办法。B段试剂1升温试剂一在升温的过程中吸光度应该是没有什么变化的，其中某些试剂在此过程中吸光度会缓慢上升共计200（0.02A）左右也是有的，但是连续的两个检测周期吸光度的波动范围正常的是在20以内。如果远远超过这个限制，比如100以上，要考虑：a）反应杯中有干扰因素：常见的是气泡或杯子不干净。可以通过肉眼观察进行验证。同时这种波动也局限于个别杯子中，其他大部分杯子会是好的。b）采集时间和光路配合不好：常见的是光电采集位置参数变化或反应盘转动不稳定。这种波动会在几乎所有的杯子中出现。而且波动的程度也相对较大。c）光路本身不稳定：常见原因是光源灯老化。光源灯使用2000小时以上便无法再保证性能。可以通过更换光源灯进行确认。C点加入样本在加入样本的一瞬间，由于样本本身是有颜色的，必然导致这一点吸光度的上升。根据样本颜色的深浅这一点的吸光度会比之前一点（加入样本之前）升高200到1000左右，唯一的例外是我们用蒸馏水作样本的时候，吸光度反而会下降200左右。如果我们在反应曲线或者反应数据中可以清楚的观察到这一点的吸光度变化，我们就可以确认样本是加进反应杯中了。同时比较重复性测试的几个相同测试的反应曲线变化值。我们就可以大致确认样本的加入量是否一致。样本加入出现的问题一般是由于样本针甩样、样本针液面检测故障、液路泄漏、样本注射器位置不固定导致的加样量不足。D段S+RI孵育时间这段时间里，样本和试剂一在37弋的环境下会进行孵育的反应。从而吸光度会有一些变化，根据项目的不同，变化的情况会不一样，但是基本上变化的程度都不大，而且这段的反应曲线应该是平稳的或者是连续变化的。如果出现明显的波动（相邻的采样周期吸光度波动超过50），要考虑是否搅拌杆有打杯的情况。E点加入试剂2加入试剂2的瞬间．理论上这一刻的吸光度应该是双试剂的试剂空白+样本光吸收的吸光度的和，但是由于仪器的检测时间和加入试剂的时间有一定的延迟，导致吸光度偏离我们的理论值（加入时反应就开始了但是周期检测不一定马上检测了）。尽管有一定的偏差，这一刻的吸光度应该依然会有一个合理的变化。比如ALT是一个吸光度下降的反应，第二试剂中没有NADH，而总体积变大，所以在加入第二试剂这一刻，吸光度应该比D段有一个明显的下降；而Y—GT是一个吸光度上升的反应，第二试剂中的有效成分会导致吸光度呈现一个明显的上升。如果E点的吸光度没有变化，我们可以考虑第二试剂是否没有加入。如果E点的吸光度变化太大，比如升到50000以上，我们必须考虑是否有可能是试剂加入过程中产生了气泡或者有污染物带入。当然，搅拌杆打杯也会导致类似的情况。F段反应开始直到结束这一阶段是连续监测法线性反应期（一般酶活力的监测方法），这时的曲线变化完全取决于当前测试的方法。终点法、动力学法、固定时间法都应该符合各自典型的反应曲线，同时要注意说明书中对反应上升和下降的描述．如果出现与预期的方法学和反应方向完全不匹配的反应曲线．我们要考虑是否试剂失效、试剂摆放错误、对试剂说明书解读错误。这一段反应曲线是生化仪获得反应度并计算出浓度的基础，如果这段反应曲线出现不正常的波动，常常会导致结果的错误常见错误有：a） 反应度不足：比如葡萄糖的测试，作为终点法，F段最后一点的吸光度和D段后端的吸光度的差值就是我们要测量的反应度。5.55g/L的反应度应该在0.3A这个数量级，从反应曲线上看吸光度的变化量应该在3000以上，如果出现反应度在不同的数量级，比如500或者20000，都应该考虑是否试剂失效或其他异常情况。b） 反应曲线波动：除了试剂样本的加入以外任何时候反应点的状态应该是稳定变化且平滑的反应曲线的波动应该不会大于20，由于不同的试剂配方和反应的不尽相同，很难给出一个确定的值来界定波动的范围。但是一般测试的波动如果大于100，就很有可能会有问题。例如搅拌杆打杯、气泡等等。同时，由于各个测试的反应度不同，吸光度的波动对测试的影响就不尽相同。反应越小收到的影响越大，当搅拌杆打杯引起的吸光度波动一般在50到300之间，对于葡萄糖（反应度为3000以上）就影响很小，但是对总胆和直胆的影响就很大，因为这两个项目在使用双试剂的时候反应度只有300左右。所以我们在检查仪器状态的时候，除了看结果，一定要看的是反应曲线的波动情况。结语检验工作一旦出现失控必须进行失控分析。产生失控的原因很多可能是随机误差也可能是系统误差。针对于全自动生