实时荧光定量PCR技术的研究进展及应用

实时荧光定量PCR技术的研究进展及应用摘要:实时荧光定量PCR技术通过检测PCR产物中荧光讯号强度来达成定量的目的,该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，并且与常规PCR相比，它含有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点,现在已在动植物基因工程，微生物和医学领域中得到广泛应用.本文对实时荧光定量PCR技术的原理，检测办法的原理、优缺点进行了评述,重点及创新点是对实时荧光定量PCR技术在医学领域，食品行业，植物方面的应用进行了比较全方面的综述，并对实时荧光定量PCR技术的普及应用及领域的前景做了进一步的展望.核心词：实时荧光定量PCR；应用;展望Researchprogressandapplicationofreal—timePCRtechnologyAbstract：Real—timePCRtechnologytodetectPCRproductbyfluorescencequantitativesignalstrengthtoachievethepurpose,thetechnologynotonlytoachievethePCRfromqualitativetoquantitativeleap，andcomparedwithconventionalPCR，itismorespecific,effectivesolutiontoPCRcontaminationproblem,degreeofautomation,hasbeenwidelyusedingeneticengineeringofplantsandanimals，microbesandmedicinefields。Inthispaper，theprincipleofreal—timePCRtechnology，principles，testingmethods，advantagesanddisadvantagesarereviewed，thefocusandinnovationisareal—timePCRtechnologyinthefieldofmedicine,foodindustry，plantaspectsoftheapplicationofamorecomprehensiveoverview，prospectsandreal—timePCRtechnologyinthefieldofuniversalapplicationandmadeafurtheroutlook.Keywords:Real-timequantitativePCR；application;Outlook聚合酶链反映(PCR）技术自1985年问世以来，以其敏捷性高、特异性强和速度快在分子生物学等科研领域得到了广泛应用。但是，由于传统的PCR技术不能精拟定量,在操作过程中易受污染而使假阳性率偏高；因此，使其应用受到限制。实时荧光定量PCR技术拥有特异性强、敏捷度高、重复性好、定量精确、速度快、全封闭反映等优点，已成为了分子生物学研究的重要工具.文章对实时荧光定量PCR技术的原理、检测办法、定量办法及其应用进行了综述。1。实时荧光定量PCR技术概述1.1实时荧光定量PCR技术的原理所谓实时荧光定量PCR技术,是指在PCR反映体系中加入荧光基团,运用荧光积累实时监测整个PCR进程，最后通过原则曲线对未知模板进行定量分析的办法[1].实时荧光定量PCR是在反映体系中加入荧光基团，使产物的数量与检测到的荧光强度成线性关系，从而得出产物的扩增曲线如图1.在PCR反映早期,不能将产生荧光的水平与背景明显区别，之后荧光的产生进入指数期、线性期和最后的平台期，因此能够在指数期的某一点上检测PCR产物的量,并由此推断起始模板含量。为了精确判断样品中某基因产物的起始拷贝数，荧光定量PCR采用参数“Ct”值，Ct值也称阈值循环(thresholdcycle），指PCR循环过程中，荧光信号开始由本底进入指数增加阶段的拐点所对应的循环次数,也就是每个反映管内的荧光信号达成设定的阈值时所经历的循环数.研究成果表明,每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系,起始拷贝数越多，Ct值越小[2］。运用已知起始拷贝数的原则样品可作出原则曲线,因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从原则曲线上计算出该样品的起始拷贝数［3］。图1实时荧光定量PCR的原则扩算曲线1.2实时荧光定量PCR技术的检测办法实时荧光技术PCR是在扩增产物聚集的过程中持续检测，即“实时”检测,根据在指数扩增期的产物量来推算初始模板的拷贝数。实时荧光定量PCR涉及探针类和染料类两种,探针类是运用与靶序列特异杂交的探针来批示扩增产物的增加。染料类如SYBRGreenI则是运用与双链DNA小沟结合发光的理化特性批示扩增产物的增加。前者由于增加了探针的识别环节特异性更高；但后者则简便易行、成本较低。1.2。1荧光标记探针按其基团标记和能量转移的方式，现在已经开发出几个有关的技术，大致能够分为水解探针和杂交探针两类。如TaqManTM探针（水解探针)、TaqmanMGB（水解探针)（Dual—oligoFRETpairs(双杂交探针)、Molecularbeacons(杂交探针)、UniversalprobelibraryLNA(lockednucleicacids（水解探针)、Simpleproble探针等[4］。（1）TaqMan探针该探针是长度为20—24b的寡核苷酸,在其5’末端标记1个荧光报告基团,3'末端标记1个荧光淬灭基团，其序列与2个引物包含序列内的1段DNA模板完全互补。该办法是当探针保持完整时运用Taq酶(5'→3'外切酶)的活性淬灭基团吸取发射的荧光。当有特异的PCR发生时，Taq酶发挥其5’→3’外切酶活性，将与模板杂交的探针切碎，报告基团与淬灭基团分离，淬灭作用被解除，荧光信号释放，通过检测系统就能够观察到信号的变化，荧光信号的累积与PCR产物形成呈正有关。每扩增1条DNA链，就有1个游离的荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同时.运用原则模板系列绘制出原则曲线，结合各样品的Ct值,能够拟定样品的起初模板量［5]。由于探针与目的片段之间的特异杂交产生荧光信号,因而此办法可通过探针增强检测的特异性,且能够提供多重检测功效.（2）TaqmanMGBTaqmanMGB探针是Taqman探针的基础上改善的，在探针的3'端增加了MGB（minorgroovebinder)分子,这种物质能够结合在双链DNA小沟部位；MGB提高了探针的TM值，从而使它能够分辨1个碱基的差别：完全配对，有荧光信号；一种碱基不匹配,则没有信号；并且连在MGB分子后的是非荧光物质的淬灭基团，因此这种探针含有更加好的淬灭效果且无背景荧光、荧光标记灵活、提高荧光信号的信噪比、提高退火温度、探针短、提高SNP识别率等优点。从而含有了更加广泛的应用前景。（3)分子信标分子信标是一种呈发夹构造的茎环双标记寡核苷酸探针，环部大小为15—35bp,能与靶DNA序列互补，茎部由GC含量较高的与靶DNA无序列同源性的互补序列构成，探针的5'端与3’端分别标记荧光报告基团和荧光淬灭基团。当分子信标处在自由状态时,发夹构造的2个末端靠近，使荧光报告基团与淬灭荧光基团靠近，产生荧光共振能量转移(FRET）效应，荧光信号被淬灭;因此,检测不到荧光信号［6］.当有靶序列存在时，分子信标与靶序列结合，使分子信标的发夹构造打开呈线型，荧光报告基团与淬灭基团彼此在空间上产生足够的距离，此时荧光报告基团不能被淬灭，荧光检测仪器可检测到荧光。随着每次扩增产物的积累，荧光强度增加，可反映出每次扩增末扩增产物积累的量.分子信标法的特点是探针可循环运用，合用于检测点突变，特异性更明显.但探针标记较复杂，并且规定其游离在溶液中时探针能无选择性折叠,当茎构造的热力学温度过高时还会影响探针与靶序列杂交.（4）双杂交探针双杂交探针技术是Roche公司开发的一种PCR定量技术，使用2个杂交探针，能提高特异性。该技术是将2条探针中的1条在5'端标记荧光,1条在3'端标记荧光，其中一种为受体荧光基团，另一种为供体荧光基团，2个探针可与模板同1条链相邻的序列杂交。在自由状态时,供体荧光基团的发射光谱覆盖受体荧光基团的激发光谱;因此，只能检测到供体荧光基团发出的荧光.在PCR退火阶段中2条探针与目的基因特异性结合，首尾连接，使供体和受体荧光距离非常靠近，两者产生荧光共振能量转移，使受体荧光基团发出荧光.由于荧光共振能量转移探针是靠近发光，因此检测信号是实时信号，而非累积信号。该办法的特点是淬灭效率高，但由于2个探针结合于模板上；因此，会影响扩增效率，并且需要合成2个较长的探针，合成成本相对较高.(5）Universalprobelibrary-LNA（lockednucleicAcids）新近Roche公司研发并建立了人类和鼠的通用探针库,其探针是由锁定核酸构成。他们通过分析人的转录组中全部不同的可能的8至9碱基序列,按照他们在转录组中出现的频率分类，找出最普便的8至9碱基序列模式制备成通用探针；每一种探针能够与7000个转录子杂交。这种探针的特异性由探针和引物共同实现。LNA是一种双RNA聚合的类似物，其2p—位的氧原子与核糖4p—碳原子形成亚甲基的桥键,并分别在5p和3p标记上荧光报告基团和淬灭基团；LNA单体掺入寡核苷序列能够增加形成体的Tm值，其稳定性比PNA高（PNAS,97：5633—5638)1因LNA与DNA杂交较DNA与DNA、DNA与RNA甚至PNA与DNA杂交有更高的亲和性，故这种探针稳定性最佳；并且探针实现了设计快速简朴、低成本的水解探针特点。普通上其公司网站后,输入基因序列号，就能订制，无需检测引物二聚体和非特异性片段。因此LNA技术实现了高熔点和高特异性结合特点;能够用于全部的荧光定量PCR仪。（6）Simple探针近来Roche公司生产一种简朴探针，这种探针只在5'端标有报告荧光，在报告荧光和5’端之间连接一种称作“linker”的构造，只有在变性阶段,探针与目的序列互补结合时,引发“linker”构造发生变化,从而报告荧光基团的荧光得以显现。这种探针的好处是不用淬灭基团，从而无背景荧光。1。2.2双链DNA（现在用于实时PCR的dsDNA结合染料，重要有SYBRGreenI和LCGreenTMI［7］。（1)SYBRGreenI是一种非饱和菁类荧光素,能够嵌合于DNA双链构造的小沟中.其处在游离状态时，检测不到荧光信号,当结合dsDNA后荧光强度明显增强,即被荧光探测系统检测到,荧光强度的增加与初始模板量有关，能够进行定量DNA分析,已有应用于临床诊疗和科学研究中的报道。SYBRGreen染料法与探针法相比,其优势在于检测办法简便，同时减少了检测成本。但是,由于该染料能够结合任何dsDNA分子，因此不能确保PCR的特异性。能够通过优化PCR的反映条件，减少或去除非特异性产物和引物二聚体的产生,另外,也能够借助融解曲线分析法来分辨非特异性产物和引物二聚体而进行定性诊疗。(2）LCGreenTMI是最新出现的一种dsDNA结合染料,与SYBRGreenI相比,该染料是一种饱和结合染料，能够完全结合dsDNA分子，可直接加入PCR反映体系中，高浓度的LCGreenTMI不会克制PCR反映。已有文献报道在PCR反映体系中加入LCGreenTMI，使用一对引物，一种不作标记的探针,结合常规融解曲线或仅使用一对引物,PCR结束后通过分析融解曲线的形状和融解温度(Tm值）的大小，对纯合子和杂合子以及寡核苷酸序列多态性（SNP）进行鉴别。LCGreenTMI染料法简便、快速、精确性高，预期将会有较好的应用前景。1.3实时荧光定量PCR技术的发展PCR技术发明以来，研究人员始终致力于用其进行核酸精拟定量。1991年Holland等[8］初次运用不可延伸的寡核苷酸杂交探针与模板结合，然后运用DNA聚合酶的5’→3’核酸外切酶活性将探针切断，使探针的能量传递构造被破坏发出荧光来定量PCR产物。1992年Higuchi等［9，10]在PCR反映管中加入EB,反映进行过程中，PCR产物增加，EB与DNA双链结合发出荧光强度也逐步增加.他们通过持续摄影动态观察荧光强度的变化,并以此定量PCR产物的多少，成为最早的实时定量PCR。1996年Heid［11］等首先报道了TaqmanPCR的原理及办法。同年,美国AppliedBiosystems公司推出商用实时定量PCR（TaqmanPCR）系列。之后,人们又设计出不同的荧光探针,如分子信标技术(molecularbeacon）[12］、LightcyclerPCR［13，14］等。随着研究的不停进展,研究人员不仅定量DNA分子，还定量RNA分子,从而进一步定量基因的体现［15]。1.4实时荧光定量PCR的定量办法实时荧光定量PCR的定量办法有2种,即绝对定量法和相对定量法［16]。绝对定量法是用已知的原则曲线来推算未知的样本量;相对定量法是在一定样品中靶序列相对于另一参考序列量的变化，由于每个模板Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，运用已知起始DNA浓度的原则品即可绘制出原则曲线.1。4。1绝对定量法绝对定量法指的是用已知的原则曲线来推算未知样本的量，此办法要预先懂得原则品的浓度。将原则品稀释成不同浓度并作为模板进行PCR反映，以原则品拷贝数的对数值为横坐标，以测得的Ct值为纵坐标绘制出原则曲线。对未知样品进行定量时根据未知样品的Ct值，即可从原则曲线中推出样品的起始拷贝数.1.4。2相对定量法（1)比较原则曲线的相对定量法相对定量法指的是在一定样本中靶序列相对于另一参考样本量的变化。由于该办法中量的体现是相对于某个参考物而言的；因此，相对定量法的原则曲线比较容易制备，对于所用的原则品只需懂得其稀释度即可。在整个实验中,待测样本靶序列的量来自原则曲线，最后必须除以参考物的量，其它的样本为参考物量的n倍.在实验中为了精确加入反映体系的RNA或DNA，普通在反映中扩增1个内源管家基因作为参考基因，由于管家基因在多个组织中的恒定体现，因此可用来作为原则,比较来源不同的样本目的基因体现量的差别.管理基因是用于比较目的基因拷贝数，根据内参考赔偿待测样本核酸抽提过程中造成的目的基因损失，反映体系内与否存在扩增克制因素及参考物原则化等［17].（2）比较Ct值的相对定量法该办法是同时扩增待测靶基因片段和内参考基因片段。这2个扩增反映能够在2个反映管中分别进行，也能够在同1个反映管中进行，测得两者的Ct值之差即ΔCt。该办法不需要原则曲线，与原则曲线法不同之处在于其运用了数学公式来计算相对量，前提是假设每个循环增加1倍的产物,以PCR反映的指数期得到Ct值来估算起始模板的量，一种循环（Ct=1)相称于起始模板数的2倍。此办法节省试剂,操作简便，但由于是以靶基因和内源控制物的扩增效率基本一致为前提的,效率的偏移会影响对实际拷贝数的预计；因此，如何优化反映体系,使得目的基因和内参基因的扩增效率相等是该办法的难点.2．实时荧光定量PCR技术的应用。2.1医学研究领域的运用应用实时荧光定量PCR检测病原DNA不仅能够定性,还能够检测出病原量的多少,为临床诊疗提供了强有力的根据.现在实时荧光定量PCR已经应用于许多病原体的检测，例如乙型肝炎病毒DNA［18］、锋利湿疣皮损中HPVD—NA[19］、与鼻咽癌关系亲密的EB病毒（Epstein-Banvirus)［20]、猪内生逆转录酶病毒［21]。Andersen等［22]用定量PCR的办法测定了结直肠癌淋巴结的癌胚抗原（CEA)mRNA的体现量，可作为诊疗癌症微转移的重要根据。Cassinat等[23]应用RQ-PCR对t（15;17）NB4白血病细胞进行了研究,其敏感性达10-6.Pongers-Willemse等［24]首先应用RQ—PCR对4例前B细胞ALL中IgH/TCR重排进行了研究,他们针对每个病例设计一种与连接区互补的等位基因特异性寡核苷酸(ASO）探针和各自特异性的一对引物，比较了RQ-PCR与斑点杂交和液相杂交检测的敏感性.成果发现其敏感性与斑点杂交相似(10—3~10-5),但低于液相杂交.刘敬忠等报道使用dsDNA结合染料SYBRGreenI，结合融解曲线分析对A-地中海贫血纯合子、杂合子作出诊疗［25]。使用双色荧光标记探针,结合不同的引物设计，能够实现对某些先天性疾病的定量检测.赵卫东等［26］通过荧光定量的办法对各细胞株的转录因子T-boxex—pressioninTcells（T-bet）、GATA3的体现水平进行检测，建立了肿瘤细胞株转录因子基因体现的荧光定量PCR检测办法，较常规PCR办法更为简便、快速、精确,有较好的应用前景。2.2食品研究运用实时荧光定量PCR技术能够对食品中致病菌进行检测。李光伟［27]等采用沙门菌fimY基因序列，设计特异引物和探针，建立了检测食品中沙门菌的FQ—PCR办法。胡建华等根据Grenbank公布的志贺菌ipaH基因的保守序列设计特异性引物，筛选适宜的DNA模板制备办法吗,以SABHGreen染料监控荧光变化的FQ-PCR与常规PCR结合，检测培养液和牛奶阳性样品中的志贺菌［28]。FQ—PCR技术除了在微生物检测中应用广泛，也是食品微生物研究中不可缺少的工具，是作为微生物生理代谢、菌群分布、菌株鉴定等的研究工具.同时PCR技术是检测转基因食品最方便快捷的办法，基于转基因特异DNA片段的FQ-PCR筛选办法已被某些国家作为有关食品法规的原则检测办法。日本和美国等13个实验室联合采用FQ—PCR办法对5种转基因玉米和1种转基因大豆进行了定量研究。成果表明这种办法能够应用于转基因作物标记制度的实际检测[29］。2。3植物研究上的运用传统的病原菌检测办法依赖于症状观察、孢子或菌落计数等手段.与传统办法相比，实时定量PCR技术含有快速、敏捷、特异等优点，不受植物症状的限制，能分辨细微差别。现在该技术在植物病原菌检测中得到越来越广泛的应用。如伍永明等[30］根据西瓜细菌性果斑病菌（Acidovoraxavenaesubsp。citrulli)与有关细菌16SrDNA序列差别，设计出对西瓜细菌性果斑病菌含有稳定点突变特异性探针Aac-probe,运用该探针对23种供试菌株进行了实时荧光PCR检测实验.植物抗病性及其机制研究始终是当今植物病理学和植物抗病育种研究工作中的热点和焦点问题。而抗病基因的研究是植物抗病性及其机制研究的基础，运用荧光定量PCR技术可检测转入抗病基因的植株中病毒的积累［31]，从而比较抗病植株与感病植株之间的病毒复制和积累的差别,为抗病基因克制病毒的复制和运动提供强有力的分子证据。3．实时荧光定量PCR的展望实时荧光定量PCR技术自1996面世以来,短短的几年就被广泛应用到生物学各个领域,涉及到的范畴涉及DNA、mRNA和病毒荷载量的定量，核酸多态性分析,基因突变分析等多个领域。但随着该技术应用的领域范畴不停扩大延伸,研究的层次不停进一步,它也开始显现出局限性:（1)减少探针制备的成本或发掘新的荧光染料；（2)进一步提高分析的敏捷度及实验重复性；(3)样品制备简朴化，程序化和机械化以节省时间减少成本.相信，实时荧光定量PCR将以其独特的优势在分子生物学、生物学和医学的基础研究和应用研究方面发挥更多更大的作用。另外，基因分析的定量化和均相化是将来基因诊疗的发展趋势,现在在该领域的研究刚刚开始，仍有许多问题需要解决,如分析敏捷度及重复性问题、自动化仪器和试剂成本、样品解决及多基因同时分析等问题.生物芯片技术与荧光探针定量技术的结合将有助于上述问题的解决[32］，届时将大大推动该技术在生命科学领域的应用普及,特别是临床诊疗领域的推广.随着科学技术与科学知识的增加，实时荧光定量PCR技术将继续被改善，新的问题被攻克，从而建立更新、更便捷、更完善的PCR体系,并应用到更广、更深的科学领域。参考文献[1］欧阳松应,杨冬，欧阳红生等.实时荧光定量PCR技术及其应用[J].生命的化学,,24(1):742－761.［2]VerderioP，PizzaMiglioS，GalloF，etal.FCI:anR－basedalgorithmforevaluatinguncertaintyofabsolutereal－timePCRquantification［J］.BMCBioinformatics，，9:13.［3]WolfgangK，JonathanN，KarasS，etal1Fluorogenicprimersforreal-timePCRAmericanBiotechnologyLaboratory,,(7）：52—56[4]王爱民。实时荧光定量PCR(TaqMan)法测定外源基因的拷贝数［J］。广西植物,，29(3）:408－412。［5］BonnetG,TyagiS，LibchaberA，etal。ThermodynamicbasisoftheenhancedspecificityofstructuredDNAprobes［J]。ProcNatlAcadSciUSA,1999,96：6171－6176。［6］BrechtbuehlK，WhalleySA,DusheikoGM，etal.Arapidreal－timequantitativepolymerasechainreactionforhepatitisBvirus[J].JVirolMethods,,93(1/2）：105－113。［7］WittwerCT，ReedGH，GundryCN，etal。1High-resolutiongenotypingbyampliconmeltinganalysisusingLCGreen1ClinChem，，49(6）:853-860。［8]HollandPM，AbramsonRD,WatsonR,etal。Detectionofspecificpolymerasechainreactionproductbyutilizingthe5’—3'exonucleaseactivityofThermusaquaticusDNApolymerase。Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1991，88:7276－7280。［9]HiguchiR，DollingerG,WalshPS，etal.SimultaneousamplificationanddetectionofspecificDNAsequences.Biotechnology,1992，10：413。[10]HiguchiR,FocklerC，etal。KineticPCRanalysis:real—timemonitoringofDNAamplificationreactions。Biotechnology,1993,11：1026－1030。[11］HeidCA,StevensJ，LivakJK，etal。Real－timequantitativePCR[J]。GenomeRes,1996,6：9862－9941。[12]TyagiS,KramerFR.Molecularbeaconsprobes：thatfluoresceuponhybridization。NationalBiotechnology,1996，14:303－308.［13］WittwerCT,HerrmannMG,MossAA,etal.ContinuousfluorescencemonitoringofrapidcycleDNAamplification.Biotechniques，1997,22:130－138。［14］WittwerCT，RirieKM，AndrewRV，etal.Thelightcycler:amicrovolumemultisamplefluorimeterwithrapidtemperaturecontrol.Biotechnique，1997，22：176－181.［15］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