一级性病实验室操作手册

实验室操作手册（性病分册）生殖器标本取材方法及注意事项男性标本:(1)如疑为急性淋病奈瑟菌或其他化脓性细菌感染应在清洗龟头部后,以碘伏或其它非粘膜刺激性消毒后,挤出分泌物立即以无菌棉拭子采取,立即送检，或以专用的细拭子插入尿道口1—2cm,旋转采取•⑵如疑为前列腺炎、精囊炎慢性淋病奈瑟菌感染应由医师按摩前列腺,以无菌手续自尿道口采取前列腺液送检.女性标本:(1)成年妇女自宫颈采取标本，应在扩阴器的支下,选取有炎症或分泌物部位,先以无菌棉拭子拭去表浅层分泌物,再用另一拭子取分泌物送检.如做厌氧或真菌培养应另外采取标本.如未成年幼女疑患性传播疾病时,不应使用扩阴器,应以无菌拭子在阴道口处采取分泌物送检.对不合格标本的处理申请单项目与标本不符.申请单姓名、科别、床号和标本的档签不符.标本已有明显的污染迹象(如开塞).送检标本不符合上述取材要求..标本过少或已明显干燥.申请单项目的项目填写不符合要求或无医师签字.送检标本的时间已明显拖延.当标本符合以上任何一条都作为不合格样本,必须重新采取样品且核对标本无误后才可以进行下一步实验.淋病的涂片检查〖原理〗急性淋菌性尿道炎病人常有大量黄色分泌物,在有些脓细胞内可有许多淋球菌,淋球菌革兰染色革兰阴性双球茵.检查分泌物涂片中有无典型细胞内革兰阴性双球茵,可作初步诊断淋病的依据.〖试剂〗采用自配革兰氏染液,试剂见试剂配制附录.方法〗1-取材:男性:拭子蘸取无菌生理盐水，插入尿道2-3cm,轻轻转动，停留数女性:宫颈拭子蘸取无菌生理盐水先将宫颈口的分泌物擦去,拭子插入宫颈内政T.5cm,转动并停留驾齐驱20-30秒，取出涂片.涂片后,待自然干燥后火焰固定,革兰染色,油镜镜检.〖结果〗部分白细胞的胞浆中有圆形或卵圆形、成双排列的革兰阴性双球茵,两茵接触面扁平或稍凹，茵体大小可有差异•菌体长约0.7um,宽约0.5um〖注意事项〗涂片时不要太用力，轻轻滚动，以免炎症细胞浆内淋球菌因细胞破坏而溢出细胞.涂片厚薄适宜•脱色时间应以涂片的厚薄而定，过厚而脱色清足时，革兰氏阴性误染成阳性.固定涂片时，只要将涂片迅速通过火焰二三次，避免加热过度使细胞变形.报告结果时应注明细胞或细胞外发现革兰氏阴性双球菌.〖临床意义〗细胞内革兰氏阴性双球菌为淋病患者的诊断标准.男性淋菌性尿道炎检出敏感性和特异性在95%以上，具有初步诊断的价值，但女性患者由于其它杂菌的影响，检出敏感性仅50%，且特异性较差，故世界卫生组织不推荐将涂片法用于女性淋病患者的诊断.同时也不推荐用于诊断淋菌性直肠和咽部感染.衣原体C—C快速免疫测定法〖原理〗本试验是将衣原体单克隆抗体的带色乳胶复合物吸附于滤纸上，将滤纸夹在二块塑料板中间.若加入的标本为阳性，则标本中的抗原与结合有乳胶的单抗结合，复合物因毛细作用向前扩散移动至结果窗，可被该处含有的未标记的鼠抗衣原体单抗所捕捉，在结果窗中出现一条黑线，标本即为阳性，过剩的未结合的带色乳胶标记的鼠抗衣原体单抗可移到质控窗，与该处的兔抗鼠抗体结合，显现一条黑线.〖试剂〗本试验采用立明试剂盒.试剂名称为:快速沙眼衣原体胶体金测定〖方法〗将试剂、反应板和塑料管自冰箱取出置室温度30分钟.2•加试剂1至塑料管刻度(0.6ml),将取材拭子放入管内，搅混80+2°C水浴10分钟—12分钟,使细胞中衣原体的脂多糖释放出来.取出后,沿管壁转动挤压拭子并丢之,加盖后放室温中5分钟冷却.将测拭板平放,加5滴提取液于检测窗,静置15分钟—30分钟后观察结果.阳性对照试验:取试剂2加5滴于塑料管,再加试剂1至刻度,以下操作按3、4进行,结果应出现阳性反应.结果〗应另取测试板进标本为阳性时,结果窗中显示一条黑色线.强阳性者黑线色深,出现时间快,出现隐约可见的黑线也判为阳性.8520/质控窗显示一条黑线,表示标本试剂质量可靠,试验正确.如30分钟内,未见黑线出现,应另取测试板进行试验.临床意义〗作衣原体诊断的参考.结果阳性表示病人可能有衣原体感染,但需要结合临床症状全面考虑.注意事项》标本中需要一定量抗原,提取的抗原低于试验敏感性时可出现假阴性,因此,每批试验应同时用阳性对照标本测试,并在质控窗和结果窗均出现一条黑线.如本试验阴性而病人持续有症状则应作衣原体培养.本试验检测的是衣原体抗原,因而不能区别是衣原体的感染还是携带者,也不能区别衣原体的死活,不能作判愈试验.不要混合不同的试剂和用具,不要盖错瓶盖.试剂中含有叠氮化钠,它与铝、铜等金属可起反应引起爆炸,应避免接触此类金属器具,处理时可用大量水冲洗,衣原体可多途径感染,处理标本时要戴手套,不要在实验室吃东西,喝水和抽烟.支原体液体分离培养和鉴定法〖原理〗解脲支原体(Uu)具有尿素酶，能分解尿素产氨，使含酚红指示剂Uu液体培养基pH值升高变碱性，液体颜色由黄变红，人型支原体(Mh)具有精氨酸酶，能分解精氨酸产氨，使分解精氨酸产氨，使含酚红指示剂的Mh液体培养基pH值升高变,液体颜色由黄变红.〖试剂〗本实验采用中山市天洋电子生物传感器有限公司生产的试剂盒.名称为:Uu和Mh的分离和鉴定液体培养基.〖方法〗1•标本采集：男性:用棉拭子取尿道内口2—2.5cm处分泌物、前列腺或中段尿沉渣（中段尿10ml2000T/min离心10分钟）.女性:取宫颈管内口1—2cm处单层柱状上皮细胞，取样拭子不可碰阴道壁,尿液不推荐.接种:将标本洗入单一Uu或Mh液体培养基，或用滤菌器过滤接种.掊养:置37°C恒温箱孵育1-3天,每日观察培养基颜色变化.结果〗液体培养基变红色，并清流澈可初步判断为Uu或Mh阳性.注意事项〗取材要准确，尤其女性宫颈拭子，要尽量多取标本.采样时旋转拭子30秒以上，取含柱状上皮细胞的样品.抽出拭子进避免与阴道壁接触.取材后应尽快接种，如果不能及时接种，应将标本放入1ml运送保存液中冰箱保存，4C易失去活力，超过48小时应放-70C冰箱保存.若是细菌污染致液体颜色变化，应及时过滤（滤膜孔径0.45um）后再培养观察是否有颜色变化或转种固体培养基掊养，阴性结果应继续观察至第5天.〖临床意义〗支原体培养阳性，说明有支原体感染，如果患者有临床症状，但其它病原体检查阴性，则应考虑支原体引起致病的可能，在部份正常人群中也可存在支原体.线索细胞检查---湿片法/干片法原理】细菌性阴道炎时阴道正常菌群发生变化，乳酸杆菌减少或消失，而阴道加特纳菌，厌氧菌等过度生长。此外，加特纳菌和厌氧菌吸附在阴道鳞状上皮细胞表面，使细胞边缘模糊不清呈锯齿状，形成有特殊外观的线索细胞。对阴道分泌物作湿片和涂片革兰染色，在显微镜下可观察线索细胞的有无和百分比多少，以及阴道菌群的变化情况。试剂】本实验采用自配革兰氏染色液，试剂见试剂配制附录。【方法】1．湿片法：在载玻片上加一滴生理盐水，将阴道分泌物与生理盐水混合成悬液，加上盖玻片后，在高倍（400倍）镜下检查。2．干片法：取阴道分泌物，涂片，作革兰染色，油镜下检查。【结果】线索细胞为阴道鳞状上皮细胞的表面覆盖着许多球杆菌（主要是加特纳菌，有时合并有厌氧菌，革兰染色不稳定），使细胞呈斑点状、颗粒状外观，细胞边缘模糊不清呈锯齿状。【临床意义】当线索细胞占全部上皮细胞的20%R以上时一般认为可诊断BV。湿片法诊断BV的敏感性在80%以上，特异性在90%以上。革兰染色镜检观察阴道上皮细胞中线索细胞的敏感性和特异性高于湿片法，分别为89%和93%。阴道毛滴虫显微镱形态学检查---湿片法原理】阴道毛滴虫运动活泼,具有旋转式的特有方式.等渗盐水可保持阴道毛滴虫维持寄生于宿主时的形态和运动状态.直接镜检.试剂】本实验采用等渗盐水.方法】将采集标的拭子放入含有少量等渗盐水的试管内,混匀后吸取一滴于载玻片上或将采集标本的拭子直接在滴有盐水的载玻片上•尿液需2000r/m离心15分钟,离心后取沉渣一滴于载玻片上.盖上盖玻片,于10X/10X显微镜下观察.【结果】等渗盐水湿片中若有阴道毛滴虫,则镱下可见梨形或水滴状,无色透明或淡蓝色虫体,大小约10-30umX5-15um,稍大于白细胞.虫体借助于鞭毛和波动膜作螺旋式跳动，运动活泼.有时可见到保护形的滋养体，其形态为外围细胞质增厚，细胞质呈均匀、光润、透明。【注意事项】女性取材时所用窥阴器,只能用少量无菌等盐水湿润.不可用润滑剂,因为一些润滑剂对阴道毛滴虫的活有形影响.从取材到观察的时间间隔越短越好,否则易影响滴虫的活动性或虫体受到破坏使检查结果受到影响.注意标本的保温,尤其冬季气温较低,影响阴道毛滴虫的活力.【临床意义】滴虫检查阳性,结合临床表现,即可做出初步诊断,应及时治疗.此法简便、快速，是门诊的常规检查方法。阴道毛滴虫显微镜形态学检查---涂片染色法原理】分泌物涂片作染色检查，可以清楚地看到虫体形态和内部结构，还能观察到阴道的微生物相、清洁度和细胞组织相。试剂】本实验采用自配革兰氏染色液，试剂见试剂配制附录。方法】3．涂片：将标本加少量生理盐水涂成薄片，置室温自然干燥。4．固定：用酒精灯火焰固定或甲醇固定。5．染色：革兰氏染色6．油镜观察结果。【结果】革兰氏染色时，滴虫易受涂片时挤压变形，可呈多形性，如梨形、圆形、长圆形、多角形等，大小差异较大，介于白细胞的2-3倍至鳞状上皮细胞的1/2之间；虫体轮廓清楚，胞浆稍呈嗜酸性，疏松泡沫，有紫红色长圆形细胞核，多在偏心位置，并偶见1-4条鞭毛，而滴虫的波动膜及轴柱难于着色，不易见。【注意事项】涂片染色受多种因素影响，上述虫体典型结构并非完全可见。涂片过程、染色过程的挤压等因素，可造成虫体大小悬殊，形态多形性，但是长圆形的细胞核，疏松且有空泡的细胞质，及偶可见到的4根前鞭毛，具有一定的特征性，不难辩认。.【临床意义】滴虫检查阳性,结合临床表现,即可做出初步诊断,有利于鉴定，并可长时间保存和利于教学。念珠菌的直接检查一．湿片法【原理】10%K0H可保持念珠菌在组织内的形态，并使菌丝及抱子具淡绿色折光，如观察到抱子，芽生孢子及假菌丝，即可作为诊断依据。【试剂】本实验采用自配10%KOH液，试剂见试剂配制附录。【方法】加1滴10%K0H于载玻片上，将采集标本直接涂在KOH溶液中，盖上盖玻片，置酒精灯火焰加热，直接用10X或40X镜检。【结果】念珠菌阳性者镜下可见略带淡绿色折光的假菌丝和成群的卵圆形孢子，孢子直径3—5um•假菌丝节间有明显的狭窄部，偶可见仅有抱子而无菌丝，可能其它酵母感染，应报告为“芽生孢子阳性”。皮屑直接镜检可见菌丝和孢子，报告应写作“菌丝、孢子阳性”。【注意事项】采集标本方法要正确，标本量要多。念珠菌性阴道炎、龟头炎的病人，仅有分泌物或伪膜而无鳞屑的病人，可直接用等渗盐水涂片作检查，这样可以直接用玻片上的标本做真菌培养。&念珠菌性龟头炎的病人，如有鳞屑应滴加10%K0H溶液，促进角质溶解，增加透明度，以利于检查。二．干片革兰染色法【原理】分泌物涂片染色后，念珠菌的假菌丝及芽生孢子可染成革兰氏阳性，更利于检出，同时还可以观察有无其它微生物及细胞组织。【试剂】本实验采用自配革兰氏染色液，试剂见试剂配制附录。【方法】1．本采集方法同10%KOH镜检法。2．涂片：将所采集标本加入少量盐水制成薄片，室温自然干燥。3．固定：用洒精灯火焰固定。4．革兰染色，油镜观察。【结果】经革兰染色后假菌丝及芽生孢子或孢子均被染成革兰阳性，假菌丝的狭窄部及孢子的特征明显，易于观察。【注意事项】革兰染色法检查念珠菌比KOH法、湿片法敏感性高，特异性高，尤其是对生殖器念珠菌的分泌物，婴幼儿皮肤念珠菌感染的检查，这些标本见芽生孢子，少见假菌丝，革兰染色比KOH法更易查到孢子。【临床意义】涂片显微镜检查的阳性率较其他方法高，但只要检查阳性即可确诊。该法具有准确率高，所需设备简单，出报告快等特点。但阴性时不能完全排除感染，仅凭镜检也不能确定为何种念珠菌感染，需作念珠菌培养鉴定。【原理】梅毒螺旋体侵入人体后，在皮肤黏膜下增殖，并很快沿着淋巴管到达附近淋巴结，经过2-4周的潜伏期，在侵入部位发生炎症反应称为硬下疳。数周后淋巴结肿大。二期梅毒是梅毒螺旋体由局部经淋巴结进入血液，主要为皮肤黏膜损害。这些损害均可检查梅毒螺旋体。用暗视野显微镜检测时，光线从聚光器边缘斜射到显微镜载玻片上的生物体或颗粒上，在黑暗的背景下发出亮光。方法】1．按常规方法取标本制成等渗盐水涂片，加盖玻片后立即镜检。2．在预先调整好的暗视野显微镜的聚光器上加数滴浸油。将标本玻片置载物台上，上升聚光器使浸油接触载玻片底面。3．用低倍物镜(10倍)对焦标本，通过调节聚光器上的光轴短矫正螺丝，使视野中光环居中，并通过上下调节聚光器的高度对焦以便得到最小直径的光环。3．特征性形态和运动方式的梅毒螺体。梅毒螺旋体在暗视野下表现为白色透明发光体。可以通过它的典型形态、大小及运动方式加以识别。它是一种纤细的(0.25-0.3um)微生物，长6-14um,平均8-14个规则、紧密的螺旋。梅毒螺旋体运动缓慢而有规律，主要有三种运动方式，即旋转式、蛇行式和伸缩式。【结果】在暗视野显微镜下，如发现有典型的梅毒螺旋体特征和运动方式为阳性结果。【注意事项】1．取材前，应用无菌等渗盐水清洁皮肤表面。2．取材时应注意无菌操作，并应取到组织渗出液，尽量避免出血，以提高检出阳性率。3．取材后应立即置暗视野显微镜下观察。4．暗视野显微镜观察要观察到梅毒螺旋体的特征性形态和运动才能确定，对口腔溃疡标本，应注意其它螺旋体的存在。5．暗视野显微镜必需经过良好培训具有经验的人员操作，以便正确地使用显微镜。【临床意义】1．当标本阳性时，依据梅毒螺旋特征性形态和运动证实螺旋体的存在，在临床上可确诊梅毒，特别是对有皮肤黏膜损害和淋巴结病变的一期、二期梅毒的诊断具有重要价值，且具有快速、方便、易操作等特点。暗视野显微镜检查法已被世界卫生组织确定为性病实验室必备项目之一。2． 当标本阴性时，未能发现梅毒螺旋体温表不能排除梅毒的诊断，阴性结果的原因可能有以下几点：标本中螺旋体数量不足(单次暗视野检查的敏感性低于50%)、患者已经治疗过、皮损已接近自然消退、或不是梅毒皮损。3． 由于口腔中除了密螺旋体外还有其它螺旋菌，因此不能推荐用暗视野显微镜检测取自口腔皮损的材料。4．暗视野显微镜是能够立即在获得性或先天性梅毒的早期进行直接诊断的唯一方法。因此被推荐用于性病临床和医院的实验室甲苯胺红试验(TRUST)原理〗人体感染梅毒螺旋体后,经过一定时间,血清中产生一定的抗类脂质抗原的非特异性反应素,与试剂中加有EDTA、氯化胆碱和磷酸盐缓冲液的抗原发生凝集反应.试剂〗本试验采用上海荣盛生物技术有限公司生产的试剂。试剂名称为：梅毒甲苯胺红不加热血清试验诊断试剂。方法〗一．定性试验离心血液,分离血清.2..吸取50ul血清放在白色卡片圈内,并均匀涂布整个圈内.3将TRUST抗原轻轻摇匀，用配套专用针头吸取抗原，每个标本中加1滴抗

原液。4．将反应板置旋转器旋转8分钟（180±5次/分钟）,5．立即用肉眼观察结果.4.结果:强阳性（+++〜++++）阳性（++）弱阳性（+）可凝（±）阴性（－）有大的或中等大小的絮状物,溶液清亮.絮状物较小,悬液较清亮.絮状物较小,强阳性（+++〜++++）阳性（++）弱阳性（+）可凝（±）阴性（－）二．定量试验1．在反应板圆圈内加入50ul等渗盐水（一般做6个滴度）。2．吸取50ul血清加到第一了混匀后，再吸取50ul至第二孔稀释，依此作倍比稀释（1：2－1：64），最后所稀释的圆圈内应弃去50ul。3．每个圆圈加加1滴抗原混匀，旋转时间和速度，观察结果同定性。4．记录出现1＋阳性反应的最高血清稀释倍数，即抗体效价。〖注意事项〗该试验反应在23—29°C,试剂合在使用前应恢至室温.用旋转式摇床，不用平衡式振荡器。试验完毕，立即观察结果。为防假阴性，试验最好用纯血清。初筛试验阳性者特别是初诊者，应做确证试验以排除生物学假阳性。避免出现“前滞”现象，对可疑者应将血清稀释后测定。临床意义〗该法为特异性试验,简便易行,具有一定的特异性和敏感性,可作为标本的初筛以作为疗效观察随访的指标.杜克雷嗜血杆菌杜克雷嗜血杆菌【原理】