生命科学低值可口革囊星虫体壁胶原蛋白特性研究

摘要以越南可口革囊星虫为原材料，采用酸法从体壁中提取胶原蛋白，对所提胶原蛋白的理化特性进行研究。通过紫外全波长扫描（UV）、SDS凝胶电泳、氨基酸分析、粘度和变性温度特性测定、凝胶强度、保湿性对胶原蛋白进行分析。结果显示，可口革囊星虫ASC紫外扫描波长在230nm处有最大吸收峰，SDS电泳结果显示可口革囊星虫ASC含有β、α1、α2链，属于I型胶原蛋白；可口革囊星虫ASC中甘氨酸、谷氨酸和脯氨酸含量较高；可口革囊星虫ASC变性温度为33.6℃，具有较好的热稳定性；凝胶强度为84.65N；保湿率与甘油相比较低。关键词：可口革囊星虫；酸法；胶原蛋白；理化特性

AbstractUsingPhascolosomaesculentasinVietnamasrawmaterials,thecollagenwasextractedfrombodywallbyacidmethod,andthephysicalandchemicalpropertiesoftheextractedcollagenwerestudied.Collagenwasanalyzedbyultravioletfullwavelengthscanning(UV),SDSgelelectrophoresis,aminoacidanalysis,viscosityanddenaturationtemperaturecharacteristicdetermination,gelstrengthandmoistureretention.TheresultsshowedthattheultravioletscanningwavelengthofASCofPhanerochaetevietnamesehadthemaximumabsorptionpeakat230nm.SDSelectrophoresisresultsshowedthatASCofPhanerochaetevietnamesecontainedβ,α1andα2chains,belongingtotypeIcollagen.Thecontentsofglycine,glutamicacidandprolineinASCofPhanerochaetevietnamesearerelativelyhigh.ASCdenaturationtemperatureofPhanerochaetevietnameseis33.6℃,whichhasgoodthermalstability.Thegelstrengthwas84.65N;Themoistureretentionrateislowerthanthatofglycerol.Keywords：Phanerochaetevietnamese；acidmethod；collagen；Physicalandchemicalcharacteristics

目录1引言 低值可口革囊星虫体壁胶原蛋白特性研究1引言1.1可口革囊星虫简介可口革囊星虫(Phascolosomaesculenta)，属于星虫动物门，革囊星虫纲，革囊星虫目，革囊星虫科，革囊星虫属动物，俗称泥蒜、土丁、沙虫等，主要分布于浙江、福建、广东等东南沿海，为中国特有物种[1]。其滋味鲜美，风味独特，且东南沿海地区产量较大，故自古以来就被沿海居民所食用，闽南风味小吃“土笋冻”就是以其为原料而制成。各类报道中表明，可口革囊星虫富含多种营养物质，具有多方面的保健功能；可口革囊星虫不仅可以食用，还可以药用。在中医理论中，不仅能有效改善阴虚潮热，气血不足的症状，还具有肾经、归脾的功效，常常用作治疗虚火上炎及滋阴补肾的治疗药物。因此可口革囊星虫也被称为“动物人参”、“海洋冬虫夏草”[2-3]。1.2胶原蛋白简介胶原蛋白是生物体内的重要蛋白质，主要存在于动物的骨骼和皮肤中，能对生物机体起到保护、支持等作用，也是哺乳动物中最广泛、最丰富的动物结缔组织和功能蛋白质的主要组成部分[4]。胶原蛋白是一种具有三螺旋结构的蛋白质，是自然界中的天然生物高分子材料，具良好的生物兼容性、生物活性和生物可降解性。胶原蛋白所具有的结构功能多样性和复杂性，在许多不同的领域有具有极大的发展潜力和广阔的应用前景[5]。随着生物化学、分子生物化学和材料科学的迅速发展，胶原蛋白所具有的特殊结构与功能将在食品、药品、化妆品、生物医学等方面广泛应用，胶原蛋白的加工应用逐渐成为关注焦点与研究热点。1.3胶原蛋白提取方法现如今，胶原蛋白的提取方法一般有酸法、碱法、酶法、盐法和热水抽提法，通过改变温度、盐浓度、pH等外界环境，使不同特性的胶原蛋白从原料中分离出来。每种方法都有各自的优缺点，在实际的操作过程中为了提高胶原蛋白的提取率，通常会将不同的提取方法相结合，提取方法的差异，也会导致所提取的胶原蛋白在理化特性上有一定差别。1.3.1酸法酸法提取是利用一定浓度的酸溶液在一定的条件下提取胶原蛋白，在实际操作中较为常用和有效。在酸提过程中胶原蛋白的三螺旋结构不容易被破坏，因此适合运用到生物医学材料领域[6]。酸提取法中主要使用的酸是柠檬酸、冰醋酸、盐酸等。王晓军等[7]报道了以牦牛骨为原料，用酸法提取胶原得率为2.24%（湿基）。1.3.2碱法碱法提取是指在一定的外部条件下用一定浓度的碱提取胶原蛋白，通常使用的碱性溶液为氢氧化钙、氢氧化钠、碳酸钠等。但碱提过程中容易导致蛋白质变性，如肽键水解，会导致水解产物分子量低，还有可能产生D、L-型氨基酸消旋混合物，部分D-型氨基酸具有毒性，也可能会有一定的致癌性，还会影响L-型氨基酸的吸收，因此，采用碱法提取胶原蛋白不能保留其的三螺旋结构。目前单纯使用碱法提取的例子不多，大多与酸相结合使用[8]。1.3.3酶法用酶法提取胶原反应条件温和、反应迅速、实验设备简单、产生污染少，并且得到的胶原水溶性、理化性质稳定。常用的酶包括胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶等[9]。目前，提取蛋白的热点是将各种酶混合使用，以获得更高的提取率。胡胜等[10]利用不同的酶提取猪皮胶原蛋白并进行研究。MasahiroO等[11]以黑鼓鱼为原料，采用酶法提取了胶原蛋白。1.3.4盐法盐法提取是利用不同的盐在不同的浓度条件下提取胶原的方法。作为溶剂使用的盐主要有氯化钠、氯化钾、乙酸钠等。胶原蛋白不溶于较低浓度的盐，当盐的浓度达到一定量时，胶原就会溶解在其中。但反应系统中存在中性盐效应，可能会对胶原蛋白的稳定性和构象稳定性造成影响，不利于提取天然胶原蛋白。Z.Deyl等[12]报道了用中性盐成功提取胶原蛋白的例子。1.3.5热水抽提法热水抽提法是将原料进行预处理，在一定条件下通过热水抽提而得到水溶性胶原蛋白的方法。该方法在实验中通常与酸、碱提取法结合使用。首先，用一定浓度的酸或碱溶液处理原料，使胶原纤维得到充分溶胀，再用热水进行抽提，就能在一定程度上提高胶原纤维的溶解性。需要注意的是，胶原蛋白的三螺旋空间结构在经过热水抽提后会被破坏，而提取的产物通常称之为明胶[13]。1.4胶原蛋白测定方法胶原蛋白的测定目前还没有直接、简便的方法，但是胶原蛋白中含有羟脯氨酸这一特有氨基酸，所以一般先测定其羟脯氨酸含量，再乘以相应的系数而计算出胶原蛋白的含量。羟铺氨酸的测定通常使用分光光度法或液相色谱法。分光光度法是一种传统的、简便的方法，且对实验条件要求低，因此实验中常用此方法进行测定。但分光光度法只能测定毫克级的羟脯氨酸，不能辨别出胶原的类型。相较而言高效液相色谱法更适宜在工业化生产中应用。色谱法能快速进行分析、且样品用量少，灵敏度高、能使分离和检测一次完成，易于实现自动化[14]。1.5研究内容及意义胶原蛋白所特有的三螺旋结构赋予其很多有用的特性，胶原作为天然的生物资源，在生物相容性和可降解性上是合成高分子材料无法与之相比的，因此，它广泛应用于生物医药、组织工程、化妆品和食品工业等领域，动物胶原蛋白已经成为一种广泛且有代表性的绿色天然生物材料。但目前胶原蛋白主要从陆地哺乳动物中提取，近年来，相关畜类疾病如狂犬病和口蹄疫的爆发次数越来越多，人们对其安全性产生质疑，并且受到了部分宗教的限制。因此，从海洋生物中提取胶原成为国内外学者关注的热点。星虫具有含丰富的胶原蛋白的体壁，星虫种类很多，有的品种味道鲜美价值高，有的味道差，食用人少，价格低廉。本论文的研究目的是以价格低廉的越南可口革囊星虫为原料提取其体壁胶原蛋白，并对其颜色、外观、胶原类型、氨基酸组成、粘度、变性温度、凝胶强度、紫外吸收峰等特性进行研究，为进一步开发利用星虫资源提供了更广阔的思路，为其进一步加工和应用提供了重要的生物学数据和理论依据。2材料和方法2.1材料、试剂与仪器2.1.1原材料越南可口革囊星虫：购于宁德宏远水产有限公司。2.1.2主要试剂氢氧化钠、正丁醇、冰乙酸、氯化钠、溴化钾2.1.3主要仪器本实验所用仪器见表2-1。表2-1实验仪器实验仪器厂家SQP电子天平赛多利斯科学仪器（北京）有限公司磁力搅拌器河南爱博特科技发展有限公司S60紫外可见分光光度计英国柏楉有限公司电泳仪（DYY-6C型）美国Bio-Rad公司乌式粘度计上海玻璃仪器厂TMS-PRO质构仪美国FTCDK-8D型恒温水浴锅上海三发科学仪器有限公司3-16PK高速冷冻离心机德国Sigma公司FDU-1200冻干机东京理化器械株式会社JSM-6490LV扫描电子显微镜JEOL日本株式会社835-50氨基酸自动分析仪日本Hitachi公司2.2试验方法2.2.1星虫的预处理将新鲜越南星虫去内脏，清洗干净，在-20℃下贮藏备用。取一定量的星虫体壁，用蒸馏水冲洗三次，去除体壁上残留的杂质。在4℃下，以1:10（m/V）的料液比添加0.1mol/LNaOH溶液浸泡并搅拌24h（NaOH溶液每6h更换一次），以去除可口革囊星虫体壁中的杂蛋白物质。然后用冰水冲洗可口革囊星虫的体壁直到中性，等完全沥干后，加入10%正丁醇以料液比为1:30（m/v），充分浸泡并搅拌24h（每6h更换正丁醇溶液一次），正丁醇用以除去体壁中的脂肪，再用冰水冲洗可口革囊星虫体壁直到中性，充分沥干，以备下次使用。2.2.2星虫体壁酸溶性胶原蛋白（ASC）的提取分别取一定量预处理后的星虫体壁加入0.5mol/L乙酸溶液，按1：20（m/V）的料液比。混合后的星虫体壁浸泡乙酸溶液在4℃下低速搅拌24h，并在9000r/min下离心30min，取其上清液。未提取彻底的星虫体壁用次同等量的0.5mol/L冰醋酸浸泡，用以彻底提取星虫的体壁，混合上清液，并将研磨精细的NaCl缓慢加入到溶液中，直至最终浓度c(NaCl)=0.9mol/L，静置过夜，利用冷冻离心机在10000r/min下离心30min，离心管内得到白色絮状沉淀；将白色的絮状物质在蒸馏水透析1天，每6h更换1次透析液。采用冷冻干燥法对透析过的胶原蛋白溶液进行冷冻干燥，得到可口革囊星虫体壁酸溶性胶原蛋白（ASC）。按下式计算胶原蛋白提取率，可口革囊星虫提取率（湿基）=（冻干后的胶原蛋白mg2.2.3颜色、质地对已冷冻干燥的越南可口革囊星虫进行色泽、质地方面的感官性状分析比较。2.2.4紫外全波长扫描（UV）依据JeevithanE等[15]的操作方法并适当调整。取适量冻干的星虫ASC样品溶解在0.5mol/L冰醋酸溶液中，制备0.5mg/mL的胶原蛋白溶液，以0.5mol/L冰醋酸溶液用作空白对照。在190-400nm近紫外光区以2nm/s的速度对胶原蛋白溶液进行扫描，分辨率为0.5nm。2.2.5胶原类型测定（SDS）利用SDS电泳分析胶原蛋白样品。取一定量的可口革囊星虫ASC，加入0.1mol/L的醋酸溶液配制成1mg/mL胶原蛋白溶液。配制10%的分离胶和5%的浓缩胶，取30µL的ASC样品溶液，再加入10µL4×上样缓冲液，在沸水中煮沸5min，在4000r/min下离心5min，离心后用微量进样器取20µL的溶液上样，100V电泳。电泳后染色、脱色，拍照观察。2.2.6氨基酸组成氨基酸采用GB/T14965-94盐酸水解法测定。2.2.7粘度、变性温度的测定取一定量的可口革囊星虫胶原蛋白，溶于0.1mol/L冰醋酸溶液中，配制成含有0.03%的胶原蛋白溶液。将制配含有0.03%的星虫胶原蛋白溶液倒入乌式粘度计，将乌氏粘度计浸入水浴锅中并进行固定，温度从15℃缓慢升高至45℃，每隔5℃测定一次，测定时要在30min内维持温度不变，使胶原溶液的温度与水浴锅温度保持一致，测量溶液通过毛细管所需要的时间，每个温度下做平行试验，重复测定3次[16-18]。以0.1mol/L冰醋酸溶液为空白对照，重复上述操作。假设胶原蛋白样品溶液密度和0.1mol/L冰醋酸溶剂的密度相同，相对粘度ηt=t/t0，粘度增加ηsp=(η−η0)/η0=(t−t0)/t02.2.8凝胶强度的测定参考HaoS等[19]的方法并稍作修改，将可口革囊星虫ASC冷冻干燥的样品切成1.0cm×1.0cm×1.0cm的立方体，使用质构仪对胶原蛋白样品凝胶的质构特性进行分析。参数设定：探头型号P/50，测试前速度1.00mm/s，测试速度1.00mm/s，测试后速度1.00mm/s；样品压缩比为40%，感应力5.0gf。每组样品平行测定3次。2.2.9保湿性的测定精确称取经过冻干后的星虫胶原蛋白的样品0.50g，放置于称量瓶内，往里加进样品质量10%的蒸馏水，取一密闭的干燥器，将称量瓶和无水硅胶置于其中，同时用甘油作对照试验，每经过一小时，测定一次样品质量，重复实验三次，按下式计算样品和甘油的保湿率。以时间为横坐标，保湿率为纵坐标作保湿曲线。Y（%）=(式中：Y—保湿率（%）；m0—试验开始时样品或甘油的含水量（g）；mt—t小时后样品或甘油的含水量（g）。2.2.10扫描电镜将适量的胶原蛋白冻干样品黏连于样盘双面胶上，蒸金处理。将样品座置于蒸金室中，对蒸金室进行抽真空，设置好时间后加电压，得到扫描结果。扫描条件：高压20kV；束流6.9×10—2mA；工作距离11.96mm。3结果与分析3.1颜色、外观星虫胶原蛋白冻干品如图3-1所示，越南星虫胶原蛋白冻干品颜色偏黄，质地硬脆。图3-1图3-1可口革囊星虫胶原蛋白冻干品3.2紫外全波长扫描（UV）可口革囊星虫ASC的紫外扫描光谱如图3-2所示。由图可知可口革囊星虫ASC在230mm处有最大吸收峰，符合胶原蛋白的特性，这与已报道的胶原的UV吸收特性一致[20]，因此可以初步判断该蛋白质为胶原蛋白。与其他类型的蛋白质不同的是，大多数蛋白质中会含有色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸等这几种氨基酸，在280nm处会有一个较强的吸收峰，而胶原蛋白几乎不含有这几种氨基酸或含量很低，因此一般在280nm处没有强吸收峰出现。图3-2中可口革囊星虫ASC在280nm处有一个小吸收峰，可能是由于提取的胶原蛋白不够纯含有杂蛋白所导致的。可口革囊星虫ASC的特征吸收波长与草鱼皮胶原蛋白[21]、鲟鱼鱼皮胶原蛋白[22]的紫外扫描光谱分析结果相似。图3-3可口革囊星虫胶原蛋白电泳图谱图3-3可口革囊星虫胶原蛋白电泳图谱注：A,B—越南可口革囊星虫胶原蛋白；C—分子量标准图3-2可口革囊星虫胶原蛋白紫外光谱图图3-2可口革囊星虫胶原蛋白紫外光谱图3.3胶原类型测定（SDS）星虫胶原蛋白SDS电泳结果如图3-3，图中显示为同一样品的两条泳带。由图可知可口革囊星虫ASC有3条带，分子量在110kDa以上，从上到下依次是β、α1、α2链，说明星虫胶原蛋白为I型胶原蛋白，并且胶原蛋白在酸提过程中没有遭到破坏和降解，结构仍然较完整。星虫ASC的SDS电泳图与海参体壁胶原蛋白[20]、鲢鱼皮胶原蛋白[23]、鲶鱼皮胶原蛋白[24]的电泳图谱相似，这说明在星虫与海参、鲢鱼、鲶鱼皮胶原蛋白分子结构类似。3.4胶原蛋白氨基酸组成可口革囊星虫ASC氨基酸测定结果如表3-1。胶原蛋白的氨基酸组成有一个显著特点，具有丰富的甘氨酸、谷氨酸和脯氨酸。因为胶原蛋白多肽链序列由Gly-X-Y氨基酸序列不断重复而成，从而甘氨酸含量在其中的占比较高。由表可知星虫胶原中甘氨酸含量最高，占总氨基酸含量的23.31%，具有典型的胶原氨基酸组成特征。经比较，可口革囊星虫ASC甘氨酸含量与鮰鱼皮[25]（23.1%）相似，低于鲤鱼皮[26]（32.5%）、草鱼皮[8]（33.6%）。本实验所提取的可口革囊星虫ASC氨基酸组成中，除色氨酸未被检出外，另外七种人体必需氨基酸含量占总氨基酸的18.89%，具有较高的营养价值。表3-1可口革囊星虫ASC氨基酸测定结果氨基酸氨基酸含量(mg/g)Asp6.27Glu10.98Ser3.12His0.24Gly16.83Thr2.12Arg7.28Ala3.56Tyr0.85Val2.90Met0.49Phe1.04Ile1.13Leu2.97Lys2.99Pro9.423.5粘度、变性温度的测定胶原蛋白的热稳定性是由其在溶液中分子的热变性温度所表达的。用乌氏粘度计测定可口革囊星虫ASC的粘度，结果如图3-4。从图中可以看出，低温时可口革囊星虫ASC比浓粘度较高，30-40℃时星虫ASC比浓粘度随温度升高变化明显，与其他报道中的胶原蛋白比浓粘度变化趋势相似。比浓粘度变化一半时的温度为变性温度，计算出可口革囊星虫胶原蛋白变性温度为33.6℃，高于刺参[27]（24.3℃）、鲈鱼(25℃)、鲫鱼[28]（27℃），与罗非鱼[29]（34.5℃）相似，具有较好的热稳定性。有研究[9]认为水产生物的生存环境的温度可能会在一定程度上影响其胶原蛋白的变性温度，因此推测这也可能是星虫胶原蛋白变性温度较高的原因。图3-5可口革囊星虫胶原蛋白凝胶强度图3-4可口革囊星虫胶原蛋白热变性曲线图图3-5可口革囊星虫胶原蛋白凝胶强度图3-4可口革囊星虫胶原蛋白热变性曲线图3.6凝胶强度的测定凝胶强度是评价蛋白凝胶作用的主要标准，具有一定的研究和利用价值。可口革囊星虫ASC凝胶强度测定结果如图3-5所示。由图可知可口革囊星虫ASC凝胶强度84.65N，具有较强的凝胶强度及弹性、恢复性。3.7保湿性的测定胶原蛋白作为一种重要的化妆品原材料，保湿性是护肤化妆品的关键指标。可口革囊星虫ASC保湿性测定结果如图3-6所示。由图可知随着时间的增加，可口革囊星虫ASC的保湿率变化趋势和甘油相似，但保湿率与甘油相比偏低，也低于鲽鱼[30]、鲤鱼[31]，保湿性能较弱。图3-6可口革囊星虫ASC和甘油的保湿性曲线图3-6可口革囊星虫ASC和甘油的保湿性曲线3.8扫描电镜胶原蛋白的显微结构对实际应用有重要影响。可口革囊星虫ASC扫描电镜结果如图3-6所示，分别为ASC在放大100倍、200倍、500倍下的扫描电镜图。从图中可以看出通过酸法提取的可口革囊星虫胶原蛋白呈现疏松、多孔、分布均匀的网状结构，且通过放大500倍的扫描电镜图能看到ASC表面较光滑，纤维呈薄片状，说明酸提取过程基本保持了胶原纤维原有的结构，比较适合运用到生物医学材料领域。注注：A：100x；B：200x；C：500x图3-6可口革囊星虫ASC扫描电镜图ABC4结论本实验从越南可口革囊星虫体壁提取酸溶性胶原蛋白（ASC），并对其理化特性进行研究，得出以下结论：1.采用酸法从可口革囊星虫体壁提取胶原蛋白提取率为2.90%，越南星虫胶原蛋白冻干品颜色偏黄，质地硬脆。2.紫外光谱扫描结果表明，可口革囊星虫ASC在230nm处有最大吸收峰，符合已知的胶原蛋白基本特征，可初步判断从可口革囊星虫体壁提取的蛋白质为胶原蛋白。可口革囊星虫ASC的电泳图有3条带，从上到下依次是β、α1、α2链，星虫胶原蛋白属于I型胶原蛋白。氨基酸分析结果表明，可口革囊星虫ASC具有丰富的甘氨酸、谷氨酸和脯氨酸，甘氨酸占氨基酸总含量的23.31%，占比最高，星虫ASC的氨基酸组成与I型胶原蛋白基本类似，且其所含人体必需氨基酸含量占总氨基酸的18.89%，具有一定的营养价值。3.通过热稳定性测定可知可口革囊星虫ASC变性温度为33.6℃，具有较高的热稳定性。4.通过凝胶强度测定可知可口革囊星虫ASC凝胶强度为84.65N，具有较强的凝胶强度及弹性、恢复性。5.通过保湿性测定可知可口革囊星虫ASC的保湿率随时间的增加而逐渐降低，保湿率与甘油相比偏低，保湿性能较弱。6.通过扫描电镜结果可知，酸法提取的可口革囊星虫ASC呈现疏松、多孔、分布均匀的网状结构，且表面较光滑，纤维呈薄片状，适合运用到生物医学材料领域。综上所述，可口革囊星虫ASC具有较高的热稳定性、较强的凝胶强度及弹性、恢复性，也具有一定的营养价值，虽然保湿性能较弱，但价格相对更低廉，具有良好的开发前景。参考文献[1]李凤鲁,周红,王玮.中国沿海星虫动物门名录[J].青岛海洋大学学报,1992(02):72-88.[2]张金鼎.海洋药物与效方[M].北京:中医古籍出版社,1998.154-155.[3]管华诗,王曙光.中华海洋本草第3卷海洋无脊椎动物药[M].上海:上海科学技术出版社,2009:78-90.[4]JongjareonrakA,BenjakulS,VisessanguanW,etal.Isolationandcharacterisationofacidandpepsin-solubilisedcollagensfromtheskinofBrownstriperedsnapper(Lutja-nusvitta)[J].FoodChemistry,2004,93(3):475-484.[5]李昀.胶原蛋白在食品和化妆品中的应用[J].天津农学院学报,2005(02):54-57.[6]余海,廖小宜,周志瑜.鼠尾肌腱胶原蛋白的提取及凝胶的制备[J].海南医学,2000(03):64-65+88.[7]王晓军,吴婷,贾伟,等.酸法和酶法提取牦牛骨胶原蛋白的特性分析[J].食品科学,2018,39(12):101-106.[8]张建忠.草鱼皮胶原蛋白的制备及性质研究[D].南京农业大学,2007.[9]刘磊.海蜇胶原蛋白的提取、纯化及理化性质研究[D].江南大学,2009.[10]胡胜,李志强,陈敏.皮胶原蛋白的酶法提取及在高附加值领域的应用[J].皮革科学与工程,2002(05):38-43.[11]MasahiroO,RalphJP,MichaelWM,etal.Biochemicalpropertiesofboneandscal-ecollagensisolatedfromthesubtropicalfishblackdrum(Pogoniacromis)andsh-eepsheadseabream(Archosargusprobatocephalus)[J].FoodChemistry,2004,(88):495-501.[12]Z.Deyl,,I.Miksik.Advancedseparationmethodsforcollagenparentα-chains,theirpolymersandfragments[J].JournalofChromatography,2000,39:3-31.[13]林琳.鱼皮胶原蛋白的制备及胶原蛋白多肽活性的研究[D].中国海洋大学,2006.[14]曹慧,许时婴.反相高效液相色谱法测定软骨中的II型胶原蛋白[J].食品工业科技,2010,31(08):348-350.[15]JEEVITHANE,WUW,NANPINGW,etal.Isolation,purificationandcharacterizati-onofpepsinsolublecollagenisolatedfromsilvertipshark(Carcharhinusalbimarg-inatus)skeletalandheadbone[J].ProcessBiochemistry,2014,49(10):1767-1777.[16]NomuraY,TokiS,IshiiY,etal.ThephysicochemicalpropertyofsharktypeIcollagengelandmembrane.[J].Journalofagriculturalandfoodchemistry,2000,48(6):2028-32.[17]NomuraY,TokiS,IshiiY,etal.ImprovementofthematerialpropertyofsharktypeIcollagenbycomposingwithpigtypeIcollagen.[J].Journalofagriculturalandfoodchemistry,200