HLA分型技术课件

HLA分型技术彭奕冰主任技师1HLA分型技术MajorHistocompatibilityComplex

(MHC)WhatisMHC?HLAH-2Minorhistocompatibilityantigens2HLA分型技术SignificanceoftheMHCroleinimmuneresponseroleinorgantransplantationroleinpredispositiontodisease3HLA分型技术Progressinorgantransplantation4HLA分型技术Geneticbarrierstotransplantationautologous:inthesameindividual(autograft)isologous:betweengeneticallyIdenticalindividuals(isograft),i.e.,identicaltwins(inbredanimals)homologous:betweenindividualsofthesamespecies(allograft)heterologous:betweenindividualsdifferentspecies(xenograft)5HLA分型技术Principlesoftransplantation6HLA分型技术Minorhistocompatibilityantigens

andgraftsurvivalminorhistocompatibilityantigensalsocauserejectionTherejectiontimeisvariablebutlongerthanthatformajorhistocompatibilityantigenTheyhaveadditiveeffects7HLA分型技术Graftversushost(GVH)disease8HLA分型技术GVHdiseaseinhumans9HLA分型技术ThehumanMHCgenes10HLA分型技术ThemouseMHCgenes11HLA分型技术PolymorphismofMHCantigens(basedonphenotype)

HLA基因系统的多态性及一些主要基因座位的等位基因数正式命名显示多态性的HLA基因座位有31个，共2320个等位基因。

图中所示为常见基因座位的等位基因数。12HLA分型技术TheinheritanceofMHCgenes13HLA分型技术Crossingover

resultsinnewhaplotypes14HLA分型技术MHCproductsexpressedoncellsIfJackandJillhavefourchildren;Bo,Kim,MoandLeeThey’llallinheritantigensoftheparentalMHCOfttheirhaplotypeswillbeofthefatherormotherUnlessduringmeiosis,acrossovershouldoccur15HLA分型技术Class-Iexpressedonallnucleatedcellsinman,andalsoonerythrocytesinmice.Class-IIexpressedprimarilyonantigenpresentingcells(dendriticcells,macrophagesandBcells,etc.)DifferentialexpressionofMHCantigens16HLA分型技术AlloreactivityofTcells:MLRandCTLgenerationCD4+TH1CD8+CTLCD8+preCTL17HLA分型技术AlloreactivityofTcellsPositiveSelectionThymusAlloreaction(MLR)ProliferationandDifferentiation18HLA分型技术InflammationlysisADCClysisIL2,IFN

TNF

,NO2IL2,IL4,IL5IL2,TNF

,IFN

rejectionMechanismsofgraftrejection19HLA分型技术Tempoofrejectionreactiontypeofrejectiontimetakencausechronicmonths-yearsunclearcauses:crossreactiveAb,immunecomplexes,slowcellularreaction,tolerancebreakdown,diseaserecurrenceaccelerateddaysreactivationofsensitizedTcells(secondaryresponse)acutedays-weeksprimaryactivationofTcellshyperacuteminutes-hourspreformedanti-donorantibodiesandcomplement20HLA分型技术A,B&DRmatchingandgraftsurvival21HLA分型技术RemovalofTcellsfrommarrowgraft

MagnetMagneticantibodies22HLA分型技术HLAanddiseaseassociationDiseaseAssociatedallelesFrequencyinRelativeriskpatientscontrolAnkylsoingspondylitisReiter’sdiseaseAcuteanterioruveitisPsoriasisvulgarisDermatitisherpetiformisB27B27B27CW6DR3979528785999332687.437.010.413.315.423HLA分型技术HLA抗原检测法24HLA分型技术微量细胞毒试验原理当特异性抗体与淋巴细胞表面HLA分子结合，激活补体，使细胞溶解。在显微镜下可见细胞被活性染料着色。Ｔ淋巴细胞只表达HLAI分子，如欲测定HLAII类分子，需用Ｂ细胞。25HLA分型技术微量细胞毒试验HLAI类分型法方法加板：Terasaki板中加入特异性抗HLAI类分子抗体。分离PBMC。制成浓度为1106/ml的细胞悬液。每孔内加入1l细胞悬液。室温培育30min。1l兔补体。室温培育60min。每孔内加入5l5%伊红水溶液。室温5min。每孔内加37%甲醛固定。倒置相差显微镜下观察结果。26HLA分型技术微量细胞毒试验HLAII类分型法与HLAＩ类分型法区别1．须用富含Ｂ细胞的淋巴细胞悬液。2．抗体与细胞培育时间为1h。3．加补体后培育时间为2h。27HLA分型技术微量细胞毒试验应用实践

个体HLA分型可用于移植前供者和受者配型，亲子鉴定，法医鉴定等。28HLA分型技术交叉配型

用于测定受者血清中受含有抗供者HLA的抗体。如受者血清中具有抗供者红细胞血型抗原抗体和/或抗白细胞抗原抗体，会引起超急排异反应。所以移植前应作红细胞血型测定，以及测定患者血清中是否具有抗供者HLA抗体。29HLA分型技术交叉配型方法1.分离供体PBMC。2.分离受者血清，作1：2，1：4和1：8稀释。加入Terasaki板，每孔1

l。其余步骤同微量细胞毒试验。如结果为阳性，表明受者血清中具有抗供者HLA抗体。30HLA分型技术细胞学分型法

细胞学分型法已被血清学和分子生物学方法代替。单相混合淋巴细胞培养实验还在使用。31HLA分型技术分子生物学技术为基础的HLA分型法原理HLA的多态性是由基因中核苷酸序列突变引起的。同一基因的不同等位基因之间核苷酸序列大多是相同的，变异集中在几个DNA片段中。在这些片断中，不同的等位基因具有特定的序列。测定这些片段的DNA序列就可以确定等位基因。32HLA分型技术

变异片段变异片段变异片段33HLA分型技术

abcdacATCGGTCAAGGCCTATCGATTGCGTAGGC

bdATCGGTCAAGGCCTATCGATTGCGTAGGC

ac