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文档简介

荧光定量PCR

北京康为世纪生物科技有限公司细胞RNA提取样品：293T细胞试剂：超纯RNA提取试剂盒、氯仿、70%乙醇方法：柱式原理：细胞在变性剂异硫氰酸胍的作用下被裂解，核蛋白体上的蛋白变性，核酸释放。释放出来的DNA和RNA由于在特定pH和盐浓度下溶解度的不同而分别位于整个体系中的中间相和水相，从而得以分离。

细胞悬液离心，倒掉上清，加入1ml

RLT；

反复吹打，使样本充分裂解；室温放置5min，使核酸蛋白复合物完全分离1.裂解：2.抽提：加入200ul氯仿，剧烈振荡15s，室温放置2min；4℃12,000rpm离心10分钟，此时样品分为三层；

上层无色水相，

中间白色蛋白质相，

下层红色有机相，

RNA在上层水相中细胞RNA提取3.过柱子：

吸取上层水相，至新的RNase-Free管中（注：不要吸到中层）加入等体积70%的乙醇，颠倒混匀；将溶液全部加入到已装入收集管（CollectionTube2ml)的吸附柱（SpinColumnRM）中。若一次(700ul)不能加完溶液，可分多次入；12,000rpm离心20s，弃废液，将吸附柱重新放回收集管中；4.

洗涤：

向吸附柱加入700μl

Buffer

RW1，12,000rpm离心20s，倒掉收集管中的废液，

将吸附柱重新放回收集管中；

向吸附柱中加入500μlBufferRW2（使用前检查是否已加入无水乙醇），

12,000rpm离心20s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；重复步骤8；12,000rpm离心2min，弃废液，吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干；细胞RNA提取5.

洗涤：

将吸附柱置于一个新的无RNase离心管（CollectionTube1.5ml）中向吸附柱的

中间部位加入30-50μlRNase-FreeWater，室温放置1min，12,000rpm离心1min，

收集RNA溶液，进行后续试验或-70℃保存RNA，防止降解。注意：1）RNase-FreeWate体积不应小于30μl，体积过小影响回收率。

2）若提高RNA的产量，可用30-50μl新的RNase-FreeWater重复步骤5。

3）若提高RNA浓度，可将得到的溶液重新加入到吸附柱中，重复步骤5。6.RNA检测：用ddH2O，对仪器进行调零；取1ul的RNA溶液进行测定；测定样品纯度和浓度。纯度：OD260/OD280=1.9-2.1<1.8蛋白质或

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