维生素C生产工艺综述

维生素C生产工艺综述摘要:介绍了维生素C的性质、功效和用途。综述了维生素C生产技术的演变过程和发展趋势。着重探讨了微生物发酵法的生产工艺进展。介绍了二步发酵法的研发现状,探讨了2-酮基-L-古龙酸的分离提取工艺。展望了我国维生素C生产技术的前景。核心词:维生素C,功效,二步发酵法,发酵,2-酮基-L—古龙酸,分离提取TheOverviewontheProductionProcessofVitaminCAbstract:Characters,functionsandusesofvitaminCareintroduced.DevelopmentalprocessandtrendofindustrialtechnologyonvitaminCarereviewed.Advancesinindustrialtechnologyofmicrobiologicalfermentationmethodarediscussedemphatically.AfterpresentsituationofR&Dofthetwostepsfermentationmethodisintroduced,theseparationandpurificationprocessesof2-keto-L-gluconicacidarediscussed.ThedirectionofindustrialtechnologyonvitaminCinChinaispreviewed.Keywords:VitaminC,Function,Twostepsfermentationmethod,Fermentation,2-keto-L-gluconicacid,Separationandextraction维生素C(vitaminC,下列简称Vc)又名L-抗坏血酸(L-ascorbicacid),是一种人体必需的水溶性维生素。Vc广泛存在于生物组织中,在新鲜水果、蔬菜和动物肝脏等中的含量尤为丰富。绿色植物能够自己合成Vc,而人和许多动物由于肝脏中缺少一种古洛内酯氧化酶,因而不能自己合成,必须从外界摄取。1.维生素C的性质、功效和用途性质纯维生素C在常温下为无色晶体,味酸,易溶于水。Vc在结晶状态尚稳定,而在水溶液中则很不稳定,容易为加热、氧化所破坏。L-抗坏血酸含有较强的还原性,在体内经抗坏血酸氧化酶的作用可脱氢氧化成L-脱氢抗坏血酸,该脱氢反映是一种可逆反映。还原型的L-抗坏血酸和氧化型的L-脱氢抗坏血酸均含有生理活性,它们构成的一对氧化-还原系统,在细胞代谢中起着重要的生理作用[1]。功效与用途Vc在人体中含有广泛的生理作用:1)参加体内氧化还原反映[2];2)对抗自由基损伤[3];3)改善机体免疫功效[4];4)参加胶原蛋白和细胞间质的合成[2];5)参加神经递质的合成[2];6)参加氨基酸代谢与铁代谢[2];7)克制血小板及白细胞活化[2];等等。因此,Vc在坏血病[5]、感冒、心血管缺点、高胆固醇、糖尿病、精神抑郁症[6]、危重型克山病等疾病的临床治疗中均含有重要的用途。另外,Vc还能够用作食品添加剂、饲料添加剂、某些农作物的催熟剂、化妆品工业防锈剂[6],等等。的生产办法莱氏法莱氏法是1933年德国化学家Reichstein等发明的最早应用于工业生产VC的办法。该法以葡萄糖为原料,经催化加氢制取D-山梨醇,然后用醋酸菌发酵生成L-山梨糖,再经酮化和化学氧化,水解后得到2-酮基-L-古洛糖酸(2-KLG),再经盐酸酸化得到VC。莱氏法生产的VC产品质量好、收率高。由于生产原料便宜易得,中间产物的化学性质稳定,至今仍是许多国外VC生产商,如Roche公司、BASF/Takeda公司和E.Merck公司等厂商采用的重要工艺办法。但是莱氏法也存在不少缺点,诸如生产工序多、劳动强度较大,使用大量有毒、易燃化学药品,容易造成环境污染等。为此,自20世纪60年代起,各国学者始终致力于莱氏法的改善。其过程如图1所示：H2/Ni醋酸杆菌丙酮/H2SO4D-葡萄糖D-山梨醇L-山梨糖双丙酮-L-山梨糖高压[O]水解化学转化双丙酮-2-酮基-L-古洛糖酸2-KLCVcNiSO4图1莱氏法生产Vc的工艺流程二步发酵法我国的混合菌发酵工艺是20世纪70年代由中国科学院微生物研究所和北京制药厂共同建立的，涉及2个发酵环节，故称两步发酵法。第一步是在醋酸杆菌作用下将D－山梨醇氧化为L－山梨糖，俗称醇糖转化，现在国外对其有关基因和转化机制的研究已经比较清晰；第二步是在一种混合菌系的作用下将L－山梨糖进一步氧化为KGA，俗称糖酸转化[7]。上述混合菌系涉及2种微生物，直接负责山梨糖生物氧化的微生物俗称小菌，最初曾被鉴定为氧化葡萄糖酸杆菌（Gluconobacteroxydans），近来Urbance等[8]经系统分类学鉴定对其重新命名为普通酮古龙酸菌（Ketogulonigeniumvulgare）。另一种微生物俗称大菌，本身不能转化山梨糖，作为伴生菌起到辅助小菌生长和产酸的作用。许多微生物含有这种伴生菌的作用，生产中惯用的有腊状芽孢杆菌（Bacilluscereus）、巨大芽孢杆菌（B．megaterium）、苏芸金芽孢杆菌（B．thuringiensis）等。现在国内Vc生产厂家都采用混合菌发酵法，该法是惟一成功应用于大规模Vc工业生产的微生物转化法，含有糖酸转化效率高的突出优势。现在我国Vc生产规模占世界总生产规模的2／3，其中80％的产品用于出口，是我国医药领域的支柱产业。混合菌发酵法在国内的成功应用也引发了国外的广泛关注。1986年，我国的两步发酵法向瑞士HoffmannLa－Roche公司进行了技术转让。其过程如图2所示：H2/Cat醋酸杆菌大菌、小菌D-葡萄糖D-山梨醇D-山梨糖2–KLG混合发酵化学转化Vc图2二步发酵法生产Vc的工艺流程大、小菌关系的研究进展二步发酵法中的第二步发酵是由氧化葡萄糖酸杆菌（Gluconobacteroxydans）和巨大芽孢杆菌（Bacillusmegaterium）混合发酵完毕的，前者为产酸菌俗称小菌，但单独培养传代存活率及产酸能力较低。后者为伴生菌俗称大菌，它不产酸，混合培养时产酸显着提高。混合发酵中大小菌两者关系复杂，始终是国内外学者研究的热点。魏东芝[9]曾提出大菌为小菌提供某种生长因子增进小菌生长的构想。冯树等[10]研究证明，大菌胞内液和胞外液均可增进小菌生长，大菌胞外液中含有该作用的组分分子量在100kDa以上；大菌胞外液含有增进小菌产酸，其胞内液无该作用；大菌胞外液中含有该活性作用的组分为30-50kDa和不不大于100kDa两个部分。其中前者是一种含铁和锌的蛋白质，该活性蛋白的形成规律和作用机制尚在探索中。焦迎晖[11]等通过分析Vc二步发酵过程中活菌产酸量、糖酸转化活力等，证明了大菌的胞外液或胞内液对小菌休止细胞的糖酸转化活力并没有直接影响，即大菌的作用仅仅是增进小菌的生长，而对产酸的增进作用是因使小菌密度提高的成果。现在，大、小菌的具体混生机制尚未完全明了，仍需人们进一步探索。菌种选育的研究有关二步发酵法中的第二步发酵过程的菌种选育始终是微生物发酵法生产维生素C研究的热点课题之一，我国学者作了大量的工作。尹光琳等[7]采用紫外照射、化学诱变和原生质体融合等办法选育得到的新组合菌系SCB329—SCB933的发酵周期仅40—50h，产酸达115—130mg/mL，转化率约为90%。焦鹏等[12]运用SMA探针技术HB—HG影印技术筛选得到了一株蛭弧菌J26，摇瓶发酵产生2—KLG的发酵单位为50—60mg/mL。通过优化发酵条件，该菌株的发酵单位已达成%—%。许安等[13]运用离子注入技术选育出的2—KLG高产菌系IPPM—1028，其转化率较出发菌M—2980提高%，发酵周期为60—64h，2—KLG浓度可达70mg/mL左右，转化率为95%。李越中[6]采用含pUB110质粒的小菌转化子（KmrSts）与Q132（KmsStr）大菌进行原生质体融合，获得可持续传代10代以上的小菌，这将为实现小菌的单独培养以及对小菌的遗传学研究打下基础。陈建华等[14]用配对法筛选得一株氧化葡萄糖酸杆菌（Gluconobacteroxydans）10—3的优良伴生菌短小芽孢杆菌（Bacilluspumilus）97002,L—山梨糖的转化率达90%左右。初步尝试两菌属间原生质体融合。尽管有关二步发酵法第二步发酵过程的菌种选育的研究进行了诸多，但仍处在实验室研究或小试阶段。发酵工艺条件的研究微生物发酵是一种极其复杂的生化反映过程。基质浓度、温度、PH等因素对微生物的生长和产物的形成都会产生直接影响。国内某些学者对二步发酵法工艺进行了进一步的研究。魏东芝等[9]研究了VC二步发酵过程的动力学，通过测定发酵中大小菌生长规律及基质和产物的变化，建立了简化的动力学模型，在一定程度上揭示了2KLG发酵系统的本质特性，为分析发酵过程，指导生产及实现生产持续自动化奠定了基础。张忠泽[15]等通过优化通气、温度和金属离子等环境因子，显着改善了二菌协同共生效果，醇酸转化率提高了%，发酵周期缩短了。针对L—山梨糖浓度不高的问题，尹光琳等[7]通过对新组合菌系SCB329—SCB933批加L—山梨糖技术的研究，既避免了高糖对菌体生长的克制作用，又能运用菌株的优良特性，使底物浓度提高到14%。康学真[16]等通过对VC二步发酵中大小菌的比例对产酸的影响，测定和分析了零级、一级、二级种子的生长曲线，得出了各级种子的最适培养时间、零级种子培养最初接种量及大小菌的接种比例，对实践有指导作用。蒋宇扬、张成刚[17]研制了几个稀土元素化合物，考察了它们对2—酮基L—古龙酸还原酶（KGR）及在L—山梨糖发酵中对2—KLG产酸的影响，摇瓶实验成果表明，在L—山梨糖发酵中加入稀土元素化合物，发酵时间缩短6h，2—KLG产酸量提高超出6mg/mL。李越中[6]采用聚乙烯/海藻酸钙包埋对大、小菌进行固定化，获得高于游离菌的产酸量；并采用种子液活化的办法使固定化细胞半衰期延长至10批次。提取工艺二步发酵法两次发酵后来,发酵液中仅含8%左右的2-KLG,而残留菌丝体、蛋白质、多糖或悬浮微粒等杂质的含量却很高。这给2-KLG的分离提纯带来了很大困难,致使后解决费用占总成本的比例较大。现在,VC工业生产中惯用的2-KLG的分离提纯办法有加热沉淀法、化学凝聚法和超滤法。(1)加热沉淀法加热沉淀法是2-KLG分离提纯的传统工艺,分离手段较为落后。此工艺通用氢型树脂,调pH至蛋白质的等电点后加热除蛋白。采用此工艺会造成有效成分在高温下降解损失,且发酵液直接通过树脂柱,造成树脂表面污染,减少树脂的交换容量和收率。两次通过树脂柱带进了大量水分,也增大了浓缩耗能。(2)化学凝聚法化学凝聚法是通过加入化学絮凝剂来除去蛋白质、菌体、色素等杂质,避免了加热沉淀时有效成分的损失。季光辉等[18]采用化学凝聚法对VC发酵液进行预解决,使2-KLG的滤液质量提高,提取前步收率提高5.2%,VC总收率提高2.5%以上。陈雷等[19]以壳聚糖为主凝剂,聚丙烯酰胺为助凝剂,通过化学凝聚法除蛋白工艺,提取收率由原来的76%提高到82%,古龙酸优级品率由原来的35%提高到60%,成本比原来减少20%。但是,化学凝聚法也存在局限性,重要体现在解决后的发酵液离心后所得的上清液中仍然存在一定量的蛋白,如发酵液染菌则解决的效果更不明显,上清液浑浊,严重影响产品的质量和收率。另外,所用的化学絮凝剂也可能对环境造成污染。(3)超滤法超滤是一种新兴的膜解决技术,此法含有操作方便、节能、不造成新的环境污染等优点,因此在2-KLG的分离提纯中的应用日益广泛[20]。此法与加热沉淀法不同的是,可在常温下操作,可减少有效成分的损失;在用膜除蛋白的过程中,无任何新的化学物质加入,可减少对树脂的污染和损耗,减少酸碱用量,减少三废排放。与化学凝聚法不同的是,在解决染菌的发酵液时仍可达成较好的解决效果。我国的东北制药厂1995年从丹麦引进现在全国最大膜面积的平板超滤装置后,2-KLG的分离提纯成本比原先的化学凝聚法节省了600万元,其收率和生产的自动化、持续化程度也明显提高[21]。随着新型膜材料技术的开发,如陶瓷膜、不锈钢膜等的应用,超滤法的应用效果会有进一步的提高。同时,国内外正在探索反渗入、纳滤等后序解决新工艺的应用,以完善工艺联结[22]。(4)其它办法除上述三种办法外,现在尚有仍处在小试阶段的离子交换法和溶媒萃取法的研究报道。刘坐镇等[23]用离子交换法对发酵液中2-KLG的提取工艺进行了研究,系统考察了四种大孔弱碱性阴离子交换树脂对2-KLG的静态和动态吸附性能以及影响因素,并对洗脱条件进行了探索。钱卫国等[24]对溶媒萃取法的提取工艺进行了初步研究,筛选出了较为适宜的萃取剂、稀释剂、助萃剂和反萃剂,考察了pH值、无机酸和相比对萃取性能的影响,并对三级逆流萃取过程进行了串联模拟。转化工艺无论是莱氏法还是二步发酵法制得的2-KLG,现在在生产上都是通过化学反映过程转化为VC。根据所选试剂的不同,二步发酵法可分为酸转化法和碱转化法[25]。(1)酸转化法VC化学转化生产,自莱氏法建立以来就采用浓盐酸催化2-KLG,一步制得VC。国外有关学者对此法进行了许多研究。印度AhmedbadTextile工业研究协会研究表明,在以饱和氯代烃(如CHCl3)、芳烃(如苯、甲苯)为溶剂,由2-KLG与浓盐酸在60～75℃下反映4～6h,可制得纯度为90%的粗VC[26]。美国学者YODICE等[27]于1985年报道了2-KLG与浓盐酸在表面活性剂Me(CH2)5N+Me3Cl的甲苯溶液中反映,可制得纯度超出99%的VC。近年来,有关一步酸转化法制VC的研究报道更是层出不穷。1999年,美国有关专利指出,在氧化钴为催化剂的体系中,2-KLG与足量的次氯酸反映可制得高纯度的VC[28]。,德国学者FECHTEL等[29]报道了2-KLG与浓盐酸在4.5Mpa的高压釜中于42℃反映3h,可制得VC,收率高达95%。酸转化法工艺简朴,操作环节少,但反映过程中选用浓盐酸对设备腐蚀严重。另外,由于在反映体系中引入了惰性溶剂或表面活性剂,使后期的分离造成不便。(2)碱转化法我国VC生产厂家均采用碱法转化2-KLG生产VC。东北制药总厂等生产单位将2-KLG与甲醇在浓硫酸催化下生成2-酮基-L-古龙酸甲酯,该酯在NaHCO3作用下发生内酯化反映生成VC钠盐。该法避免了酸催化的上述缺点,且操作工艺简朴,反映条件温和,适合于规模化生产,但是在生产中的反映周期过长,甲醇单耗高[30]。有些单位尝试用CH3ONa替代NaHCO3进行碱转化,转化率可高达92.6%,但产品质量较差,且甲醇钠价格贵,造成生产成本较高[31]。国外学者对碱转化的研究也始终在进行。Bottcher等[32]用丁醇替代甲醇,采用浓硫酸催化,在真空度0.02MPa、85℃的条件下与2-KLG进行反映,2h后蒸去多出的丁醇及生成的水,向反映体系中加入氯乙烯和盐酸,在72～75℃加热17h,过滤后得到纯度为98%的VC。Veits[33]用离子交换树脂作催化剂,使2-KLG与甲醇的反映液于80℃下在树脂柱中停留10～120min,然后将酯化液与NaHCO3作用得到纯度为98%的粗VC钠盐。美国Fastman化学公司的研究人员将模拟流动床(SMB)反映器应用于该酯化反映,通过SMB反映器脱水以增进酯化反映的进行[34]。Oklobdzu等[35]通过二步酯化过程增进酯化反映的进行,有效地实现了分离反映产物和反映过程中生成的水。由VC钠盐制备VC所采用的重要办法是硫酸酸化法和树脂交换法[36]。硫酸酸化法操作简朴,但需妥善控制甲醇的浓度和pH值,才干使硫酸钠与VC得以分离。氢型离子树脂交换法设备庞大,操作复杂,且需经常再生树脂,增加了酸耗,酸液大量排放容易对环境造成威胁。现在,人们正在主动探索使用双极性膜(BipolarMembraneElectrodial2ysis,BME)来替代传统的酸化工艺[37～39],其工作原理为:在直流电场作用下,双极性膜中的水被离解成H+和OH-,H+替代VC钠盐中的Na+结合成离解度小的VC,原VC钠盐中的Na+在电场的作用下通过阳离子交换膜从VC钠盐中分离出来,并和OH-结合生成NaOH。双极性膜电渗析法无需外加物料可将VC钠盐转化成VC,过程简朴,能耗低,投资少,转化率高,其副产品和NaOH稀溶液也可被有效运用,对环境无污染,有望应用到实际生产中。新二步发酵法新二步发酵法最先是由日本盐野义制药公司园天高康等发明的，也称葡萄糖串联发酵法[40]，其工艺流程如图3所示。欧文氏菌帮杆菌化学转化D-葡萄糖2,5–DKG2-KLGVc图3新二步发酵法工艺流程园天高康等[41]用欧文氏菌SHS突变株和棒状杆菌SHS的突变株进行10t串联发酵的中间实验表明，由葡萄糖到2—KLG的总转化率为84%。我国的尹光琳[7]等20于20世纪90年代初已经开始进行这方面的研究，他们诱变选育出欧文氏菌（Er-winiasp.）SCB247产2,5—DKG的能力提高了%，所得到棒状杆菌诱变株SCB3058含有较高的产2—KLG能力（mL）。另外，张刚等[42]对SCB247和SCB3058串联发酵产2—KLG的工艺条件也做了研究，得出了类似的成果。这些研究为进一步简化的生产工艺打下了基础。新二步发酵法省去了D—葡萄糖加氢生成D—山梨醇的环节，大大简化了生产工序，收率也很高，很有应用前途。但这种办法还存在许多问题，如中间产物2，5—DKG对热不稳定，转化效率低，成本高。其在反映条件、菌体运用等方面，与工业生产还含有一定的距离。一步发酵法不能以葡萄糖作为直接发酵原料是二步发酵法的最大缺点之一。以D-葡萄糖高压加氢转化生成D-山梨醇,不仅需要大量的能源和设备,操作上也存在很大的危险性。考虑若能将欧文氏菌和棒状杆菌有关的特性结合于一种微生物中,构建VC“基因工程菌”,就可实现从D-葡萄糖到2-KLG的一步发酵。近年来,基因工程菌的研究已成为世界上热点课题之一,美国、瑞士、法国、日本等许多国家都着力开展了此方面的研究。其过程如图4所示：工程菌化学转化D-葡萄糖2-KLGVc图4一步发酵法工艺流程1985年,美国Genen2tech公司Anderson等人[43]成功地分离纯化了棒杆菌(Corynebacteriumsp.)ATCC31090的2,5-DKG还原酶,并分析了该酶N-端的40个氨基酸序列,用原位杂交法从部分基因文库中筛选到一种基因片段,再以已知片段为探针得到了完整基因,最后该基因被重组到了另一株发酵生产菌草生欧文氏菌(E.herbicolaATCC21998)中,得以有效体现,从而实现了从D-葡萄糖到2-KLG的一步发酵。该法的合成效率很低,只有5%左右,重要是由于合成2,5-DKG的3种核心酶D-葡萄糖脱氢酶、D-葡萄糖酸脱氢酶、2-酮基-D-古龙酸脱氢酶(存在于周质中)与2,5-DKG还原酶(存在于胞质)在细胞中所处位置的较大差别造成。后来Grindley等[44]通过改善,将棒杆菌的2,5-DKG还原酶的基因在E.citreus上体现,将收率提高至49%。国内部分VC生产厂家以及中科院上海生物工程研究中心也在进行此项课题的研究,并获得了很大的进展。陈策实等[45]从棒状杆菌SCB3058中初步纯化得到的2个2,5-DKG还原酶,将2,5-DKG还原酶I基因片段在大肠杆菌中得到体现。全部这些都为最后构建基因工程菌打下了基础。由于至今尚未找到使葡萄糖直接发酵产生VC的微生物菌种,现在发酵产生的2-KLG到VC的转化仍是通过化学办法。为了得到完整的使用细菌合成VC的生物转化途径,各国学者都在寻找能够运用2-KLG合成VC的菌种。现在,Asakura等人[46]已从Zymomonasmobilis,Es-cherichiacoli以及Fusariumoxysporum中分离出了内酯化酶,能够用于2-KLG到VC的转化,但是反映效率极低,尚有待进一步研究。3.展望VC是我国自主知识产权开发的首批西药之一,也是我国最重要的出口创汇原料药之一。二步发酵法是我国VC生产的重要工艺办法,然而该法不能直接以葡萄糖为发酵原料,且涉及二步发酵三种菌,工序繁琐。采用基因工程等先进技术,选育直接以葡萄糖为发酵原料的优良菌株和优化发酵条件将是我国VC生产技术研究的重要方向。另外,现在世界上诸多国家正尝试以真核生物为研究对象,运用它们合成VC的代谢途径开发更加环保的生物合成办法[47～49]。从我国的二步发酵法推广后逐步取代莱氏法这一过程能够预测,随着生物技术的不停发展和更具优势的生物合成VC办法的不停涌现,生物法必将完全取代化学法在VC生产中的地位。为了保持我国在世界VC生产上的优势地位,必须加强VC生产的基础研究工作。参考文献：[1]PrazeresDMF,CabralJMS1Enzymaticmembranebioreactorsandtheirapplications1EnzymeMicrob1Technol.,1994,16:738-750[2]鲍扬.维生素C与营养.肠与肠内营养,1998,5(3):168-172[3]ConnerEM,GrishamMB1Inflammmionfreeradicals,andan-tioxidants1Nutrition,1996,12:174[4]JengKCG,YangCS,SiuWY,etal1SupplementationwithVitaminCandE-enhancescytokineproductionbyperipheralbloodmononuclearcellsinhealthyadults1Am1J.Clin1Nutr,1996,64:960[5]HalliwellB1Ascorbicacid;hype,hoax,orhealerAm.J..,1997,65:1891[6]李越中.维生素C二步发酵法第二步发酵混合菌的生理机制暨混合菌共固定化合成2-酮基-L古龙酸的研究.[博士后研究报告].沈阳:中科院沈阳应用生态所[7]尹光琳,陶增鑫,于龙华,等．L－山梨糖发酵产生Vc前体2－酮基－L－古龙酸的研究．I．菌种的分离筛选和鉴定[J]．微生物学报,1980,20(3):246－251．[8]UrbanceJW,BratinaBJ,StoddardSF,etal．TaxonomiccharacterizationofKetogulonigeniumvulgaregen．nov．sp．nov．andKetogulonigeniumrobustumsp．nov．,whichoxidizeL－sorboseto2－keto－Lgulonicacid[J]．IntJSystEvolMicrobiol,,51(3):1059－1070．[9]魏东芝，袁渭康，尹光琳，等;维生素C二步发酵法过程动力学模型的研究[J].生物工程学报，1992,8(3):277-282.[10]冯树，孙传宝，张忠泽，等;维生素C二步发酵中巨大芽孢杆菌对氧化葡萄糖酸杆菌生长及产酸的影响[J].微生物学杂志，1998,18（1）：6-9[11]焦迎晖，张惟材，等;维生素C发酵中伴生菌对氧化葡糖杆菌的影响[J].微生物学通报.,29(5):35-38[12]马成新，焦鹏，胡江春，等;蛭弧苗J26转化山梨糖生产2-酮基-L-古龙酸发酵条件的研究[J].微生物学杂志，1998,18(2):1-6[13]许安，姚建铭，余增亮，等;离子注入改良维生素二步发酵混合菌的研究.2-酮基-L-古龙酸高产菌IPPM-1028的选育[J].工业微生物，1998,28(4):21-24[14]陈建华，冯瑞山，郗丽萍，等.2-酮基-L-古龙酸产生菌原生质体的属间融合[J]中国医药工业杂志，,33(1):9-11,24[15]周彬，张忠泽，等，VC二步发酵中的微生物生态调控[J].应用生态学报.,13(11):1452-1454[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