林木重要性状相关基因的分离与鉴定

林木重要性状相关基因的分离与鉴定

该树在净化大气、防止风和沙、保持水土、保持生态平衡和生物多样性、优质木材和优质林地方面发挥着重要作用。它具有显著的生态效应、社会效应和经济价值。传统的育种手段如引种驯化、杂交育种、选择育种等难以实现林木高抗优质多性状综合改良的需求。近年来生物技术的发展、分子标记辅助选择技术的运用以及基因工程研究的兴起,为利用基因工程手段改良林木、加速林木新品种的选育奠定了基础。林木等木本植物基因资源丰富,遗传多样性复杂,但许多天然优良基因尚未被分离利用,大部分基因的功能仍处于未知状态。各种模式植物基因组测序的完成,特别是杨树基因组测序计划的完成,并结合连锁和连锁不平衡的分析方法,大大促进了木本植物功能基因的克隆和功能基因组学的研究(尹佟明2010)。近年来,林木功能基因陆续被分离和鉴定。Yamamoto等(1988a)从黑松(Pinusthunbergii)中克隆了首个来自林木的基因——核酮糖二磷酸羧化酶基因。到目前为止,为达到改良材性、缩短花期、抗干旱和病虫害等育种目标,科研人员分离的林木来源的基因总数达到470个以上,运用到的克隆技术主要有:RACE技术、RT-PCR技术、mRNA差别显示技术(DDRT-PCR)、抑制性差减杂交(suppressionsubtractivehybridization,SSH)、核酸探针分离目标基因和酵母单杂交技术等。对这些基因的分析鉴定,主要采用与拟南芥(Arabidopsisthaliana)、烟草(Nicotianatabacum)等的同源基因进行相似性比较,构建分子进化树,或对蛋白质结构域和功能进行预测分析;通过半定量和定量RT-PCR技术,研究目的基因在某种时空状态或胁迫环境下的表达量。运用反向遗传学方法,通过基因超量表达技术、反义RNA技术、RNA干涉和转基因技术研究林木基因的功能,填补或完善基因功能注释,阐述多年生林木生物学性状的基因表达调控机制正成为当前林木基因克隆及应用研究的热点。本文综述了近20年来国内外林木基因克隆的研究进展,并对今后该领域的发展趋势进行了展望。1功能基因序列近几年国外在林木的木材形成调控和花发育机制、抗旱耐盐和抗氧化胁迫等方面做了大量研究,从杨树、松树、桉树、柳树、柽柳(Tamarixchinensis)、白桦(Betulaplatyphylla)和银杏(Ginkgobiloba)等植物中克隆获得了387个功能基因,其中参与木材形成的有87个,花发育49个,抗冻21个,抗旱9个,抗病9个,抗虫3个,防御机械损伤3个,抗氧化7个,耐重金属污染5个及其它功能的基因194个。上述各基因及其功能详见表1和表2。1.1转录因子pta基因对维管组织的影响木质素生物合成途径中的关键酶基因PtCOMT、F5H、4CL、CCR、CCoAOMT和CAD等均已从毛果杨(Populustrichocarpa)、美洲山杨(Populustremuloides)、火炬松(Pinustaeda)中克隆(Doorsselaereetal.,1995;Huetal.,1998;Lietal.,1999,2005;Siboutetal.,2002;BhuiyaandLiu,2009)。利用基因工程技术对这些基因进行表达调控,可以有效改变木质素组成或降低木质素含量,培育新型能源品种,从源头降低造纸成本,减少环境污染(高原等,2007)。除此以外,Ko等(2005)从欧洲山杨×毛白杨杂交杨(Populustremula×Populustomentosa)中克隆到classIIIHD-Zip转录因子PtaHB1基因,该基因被证实在维管组织分化中起调控作用。Samuga和Joshi(2004)从美洲山杨中分离到PtrCSLD2全长基因,其在木质部次级细胞壁有较高丰度的表达,参与纤维素生物合成。PoptrMP1和PoptrMP2属于MONOPTEROS(MP)/AUXIN响应因子,PoptrMP1集中在毛果杨次生木质部表达,过量表达PoptrMP1导致作用的下游靶基因的转录量提高2–4倍,两者可能在维管组织的发育中起作用(JohnsonandDouglas,2007)。Sonoda等(2009)将赤桉(Eucalyptuscamald-ulensis)HD-ZipclassII转录因子EcHB1基因转入烟草,转基因植株纤维长度和干重增加,叶片、根部和茎部的生长量均明显高于对照。Lee等(2009)的研究证明,RNA干扰(RNAi)技术抑制PoGT47C的表达后,转基因银白杨×欧洲山杨杂交杨(Populusalba×Populustremula)植株次生细胞壁厚度明显减小,葡糖醛酸木聚糖的合成受阻,导管外观变形,纤维素含量下降。最近,MYB转录因子PtrMYB3和Ptr-MYB20及NAC转录因子PtrWND2B和PtrWND6B均被证实参与纤维素和木质素的生物合成,并参与调控木材形成(McCarthyetal.,2010;Zhongetal.,2010)。1.2辐射松的ptm3/4基因林木树种存在生长周期长、生殖发育滞后的特点。目前已从美洲山杨、辐射松(Pinusradiata)和巨桉(Eucalyptusgrandis)中分离了一些参与花形成和发育的基因——MYB、PTM、PMADS2、PTLF、PRFLL、NEEDLY、FT2,为通过基因工程手段进行开花调控,缩短花周期,获得提早开花或花期不育的转基因新品种打下良好基础(Mellerowiczetal.,1998;Mouradovetal.,1998;Rottmannetal.,2000;Csekeetal.,2003a,2003b;Liuetal.,2003;Hsuetal.,2006;Mellwayetal.,2009)。花发育基因PTM3/4为美洲山杨SEPALLATA-classMADS-box基因,其在转基因烟草、拟南芥、美洲山杨中均参与季节性的开花调节(Csekeetal.,2005)。辐射松的NEEDLY(NLY)基因与拟南芥LEAFY/FLORICAULA基因高度同源,转基因LFY::NLY植株可以互补花发育途径中对应基因LFY的缺失,表明NLY与LFY在功能上具有相似性(Mouradovetal.,1998)。Dornelas和Rodriguez(2006)运用Northern杂交和原位杂交技术研究了雪松(Cedrusdeodara)FLORICAULA/LEAFY同源基因CfLFY的表达量,发现CfLFY集中在花分生组织和花芽中表达,参与了雪松的开花调控。1.3天幕毛虫基因诉讼将抗虫基因引入树木细胞并使其在受体细胞内稳定地遗传和表达,使林木树种获得对昆虫的抗性,成为树木抗虫育种的一种新手段。林业上应用较为普遍的抗虫基因,常见的有Bt毒蛋白基因、蛋白酶抑制剂PI基因和昆虫神经蝎毒素AaIT基因等,部分抗虫转基因林木进入田间实验后不可避免地存在生态风险等问题。林木自身同样具备抗虫基因资源,近年从喜树(Camptothecaacuminata)、毛果杨×美洲黑杨杂交杨(Populustrichocarpa×Populusdeltoides)中分离的TDC、win3等基因显示出抗虫功能。López-Meyer和Nessler(1997)将喜树的色氨酸脱羧酶基因TDC转化到欧洲山杨×银白杨杂交杨(Populustremula×Populusalba)中,过量表达TDC(35S::TDC)的转基因植株叶片色胺积累,对天幕毛虫的侵害起到很好的阻抑作用。win3的编码产物与豆荚种子Kunitz型胰蛋白酶抑制剂有很高的相似性,可能是一种胰蛋白酶抑制剂基因,能够抑制害虫胰蛋白酶原的激活或胰脏中其它蛋白酶原的活化,干扰害虫的消化吸收,起到防治害虫的目的(Bradshawetal.,1989)。林木病害的病原菌种类多,变异速度快,分离、纯化工作不易进行。以前树木病害的研究主要集中在抗病QTL与抗病质量性状定位,以及抗病基因相似序列的克隆与鉴定方面。转基因技术研究主要利用外源的病毒外壳蛋白基因CP、几丁质酶基因Chi和抗菌肽基因LCI等,导入目标树种中,以提高林木的抗病性。近年来从樟子松(Pinussylvestrisvar.mongolica)、加州山松(Pinusmonticola)和火炬松中克隆了PsDef1、PmCh4A、PtTPS-LAS和PtAO等抗病毒基因,大大促进了林木抗病基因工程的研究进程。Kovalyova等(2007)从樟子松中分离获得了长度为252bp的防御素基因PsDef1,其具有广谱、高效的抗微生物活性。几丁质酶是植物抗真菌酶,外源茉莉酮酸、蛋白磷酸酶1A、2A抑制剂处理和机械损伤均导致加州山松中PmCh4A蛋白的积累增加,显示了几丁质酶基因PmCh4A在防御疱锈病和非生物胁迫方面的重要作用(Liuetal.,2005)。Ro和Bohlmann(2006)从火炬松中分离了PtTPS-LAS基因,其编码二萜合酶。二萜合酶是二萜醌类化合物生物合成的一个关键酶。萜类化合物具有抑制真菌活性的作用,可以避免林木受到真菌感染。1.4盐胁迫对植物抗氧化酶系统的影响在干旱胁迫下林木自身的调控基因和功能基因均被诱导表达。调控基因编码DREB、MYB/MYC和bZIP等转录因子,它们与响应水分胁迫的顺式作用元件相结合,从而激活下游基因表达。渗透调节物质——蔗糖、脯氨酸、水通道蛋白和LEA蛋白等属于功能性基因的表达产物,可直接参与减轻干旱胁迫所造成的危害。干旱胁迫应答基因编码蛋白——LEA蛋白是一类重要的脱水素,具有高度亲水性,能够保护细胞免受水分胁迫的伤害。欧洲栎(Quercusrobur)和欧美杨(Populuseuramericana‘Dorskamp’)的脱水素基因QrDhn1、QrDhn2、QrDhn3、peudhn1均能够响应外部缺水条件,其表达量明显提高,具有增强植物脱水耐性的功能(Carusoetal.,2002;Šunderlíkováetal.,2009a)。Mayne等(1997)报道了加拿大短叶松(Pinusbanksiana)干旱诱导基因JPD16和JPD18,在外源10λmol·m–3ABA作用1小时后,其在植株根和针叶部的表达量明显上升。Chang等(1996a)从遭受水分胁迫的火炬松根部cDNA文库中分离到pLP5,该基因可能编码细胞壁增厚蛋白,防止植株脱水萎蔫。欧洲水青冈(Fagussylvatica)ABA响应基因FsDhn1编码晚期胚胎富集蛋白LEA,在欧洲水青冈种子干燥的条件下,LEA蛋白受诱导特异表达,表明FsDhn1是一个干旱诱导基因(Jiménezetal.,2008)。喜树CaAOC基因受盐环境诱导表达,原核表达实验表明,转化子能在400mmol·L–1NaCl的高盐培养基中正常生长,且盐胁迫下转基因烟草的叶绿素含量明显高于对照(Pietal.,2009)。植物适应低温反应的产生有依赖ABA和非依赖ABA两种途径。前者包括ABA应答元件和带有bzip基序的ABA应答元件结合蛋白;后者包括CRT/DRE顺式作用元件和CBF结合蛋白(CRT/DRE-bindingfactor)等重要构件。Kayal等(2006)从冈尼桉(Eucalyptusgunnii)分离的冷诱导基因EguCBF1a和EguCBF1b,编码CRT/DRE结合因子,能够响应短日照和低温胁迫。Puhakainen等(2004)从白桦中克隆获得低温诱导基因Bplti36,并发现在短日照和低温处理下,Bplti36转录水平显著上升。白桦脂肪酸生物合成基因BpFAD3、BpFAD7和BpFAD8,参与亚油酸(18:2)转变为α-亚麻酸(18:3)的过程;低温能诱导BpFAD3和BpFAD8的表达,但抑制BpFAD7的表达,使α-亚麻酸(18:3)含量增高,脂肪酸不饱和性增加,从而提高白桦的抗寒能力(Martzetal.,2006)。逆境胁迫下植物的抗氧化系统主要由超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和谷胱甘肽(GSH)等抗氧化物组成,它们协同作用抵抗活性氧对植物机体的伤害。其中关键的抗氧化酶基因——铜/锌超氧化物歧化酶基因PtSodCcl,由Akkapeddi等(1999)从臭氧胁迫的美洲山杨叶片基因组中克隆,Northern杂交结果显示,PtSodCcl对臭氧诱导敏感,其表达量迅速上升,推测其能够清除臭氧的胁迫毒害。夜叉桤木(Alnusfirma)血红素Hb基因AfHb1受NO诱导,促使NO清除剂的产生,从而降低NO胁迫对机体的损害(Sasakuraetal.,2006)。此外,Sillanpää等(2005)的研究认为,半胱氨酸蛋白酶基因Cyp1和Cyp2参与白桦叶片衰老的调控,是一种重要的抗氧化物质。当今环境污染日趋严重,树木自身具备一定的修复功能,对维持生态平衡和抵抗环境恶化具有重要作用。近年来,基因工程技术逐渐成为对被污染环境进行生物治理的有力工具。从杨树中分离的PtdMTP1、白桦的MRP4等基因及其应用,对于阐明树木抗环境污染的机制有重要意义。PtdMTP1基因从毛果杨×美洲黑杨杂交杨中克隆得到,具有解除Cd和Zn胁迫的能力,并对抑制Co、Mn和Ni等重金属的富集有一定效果(Blaudezetal.,2003)。Keinanen等(2007)运用抑制消减杂交(SSH)技术从Cu胁迫的白桦中获得耐重金属基因MRP4,其在根与芽部的表达量显著上升,参与消除重金属Cu对生物的毒性。2林木基质基因的转化我国自20世纪80年代末期开始林木转基因的研究主要采用叶盘法和基因枪等转化方法,将农作物或细菌的基因转化至林木基因组中。利用林木基因进行遗传改良虽然起步较晚,但发展迅速,已获得具有潜在应用价值的新基因80多个,其中参与木材形成的有15个,花发育7个,抗冻4个,抗旱15个,抗病2个抗虫2个,抗氧化1个,耐重金属污染3个,其它功能基因35个。上述各基因及其功能详见表1和表2。2.1其他化学成分参与细胞的分化和基因表达国内科研人员从欧美杨107(Populusxeuramericana‘74/76’)、毛白杨(Populustomentosa)、尾叶桉(Eucalyptusurophylla)中分离克隆了PAL、CCoAOMT、4CL、C3H及COMT等参与木质素生物合成的关键基因,为利用基因工程调控林木木质素的研究奠定了基础(魏建华等,2001a,2001b;薛永常等,2004;孔华等,2008;聂会忠和薛永常,2008)。另外,Li等(2009)的研究认为,细胞周期蛋白依赖性激酶基因CDKB和CYCB参与毛白杨形成层细胞分裂。扩展蛋白expansin是植物细胞壁松弛因子。张春玲等(2006)利用RT-PCR从毛白杨树干形成层部位克隆了编码该蛋白的PtEXP1基因,PtEXP1可能参与形成层细胞向木质部细胞的分化。欧阳昆唏等(2010)采用RACE技术,以团花树(Anthocephaluschinensis)枝条形成层的cDNA为模板,克隆得到扩展蛋白全长基因AcEXP1。李春秀等(2007)从毛白杨中克隆获得长度为3215bp的纤维素合成酶基因PtoCesA1;35S::PtoCesA1转基因烟草株系生长受到抑制,其基部木质部厚度比对照植株和野生型植株小,纤维细胞壁厚度也有所减小,表现出反义抑制的表型,可能发生了转录后基因沉默(post-transcriptionalgenesilencing,PTGS)现象。贺郭等(2010)根据毛果杨NAC068基因设计引物,从毛白杨基因组中克隆得到该基因5’侧翼区901bp长的片段pProNAC068;该启动子介导的GUS活性检测表明,其在形成层区域启动表达的强度比35S启动子的高。2.2花芽方面的基因表达培育不育的转基因林木新品种可以有效减少转基因花粉引起的基因逃逸。例如王冬梅等(2005)构建了毛白杨PtAP3基因的正反义表达载体,并获得转基因烟草植株,下一步将开展毛白杨的遗传转化工作,以期实现干扰毛白杨等树种的开花,使花器官败育,从而控制毛白杨飞絮污染。PtAP3具有高度保守的MADS-box区,在毛白杨花发育调控过程中作为转录因子发挥作用。苏晓华等(2009)从美洲黑杨(Populusdeltoides)雄性花芽cDNA文库中分离得到MADS-box基因PdPI,其在花蕾的表达量明显高于其它各组织部位;转基因研究结果表明,转正义PdPI基因的烟草植株提前开花,而转反义基因的植株与对照相比无明显差异。PdPI在花蕾、雄花序的花被和花药中表达量高,在花梗和成熟花粉中的表达量低,与花器官的发育和开花调控密切相关(Zhangetal.,2008a)。安新民等(2010)从毛白杨花芽中克隆了PtLFYcDNA序列,其在雌雄花芽发育过程中的差异表达表明PtLFY参与花芽的形态分化。GinNdly是花分生组织基因LEAFY的同源基因。张建业等(2005)利用银杏GinNdly基因构建了正义与反义植物表达载体,转基因的研究还在进行当中。2.3．体制型基因病毒、真菌和细菌有着多变的致病机制,由它们引起的林木病害相当严重,每年因森林病虫害造成的经济损失高达数十亿元。相比农作物,树木抗病基因的研究较缺乏,目前国内克隆的抗病基因仅有PtDRG01和dir。李琰等(2008)构建了NBS型抗病基因PtDRG01的原核表达载体,导入大肠杆菌,经IPTG诱导表达获得目标长度的特异表达蛋白,为下一步的蛋白功能研究奠定了基础。李海霞等(2009)将毛白杨的PtDRG01基因导入烟草,转基因烟草株系TG-11叶片中的烟草花叶病毒(TMV)数量显著少于非转基因植株,表明PtDRG01基因具有抗病毒功能。高彩球等(2006)通过构建柽柳cDNA文库,挑取单克隆测序获得dir基因的cDNA全长序列;dir基因编码产物参与木质素的合成,与柽柳的病菌防御有关。天牛可对多种林木造成危害,杨树、柳树、槐树等均受其直接威胁,林区受害面积大,造成的经济损失惨重。对此,相关专家开展了一系列研究。张星耀等(2007)将来源于河北毛白杨形成层的巯基蛋白酶抑制剂基因CPI,转入到天牛易感树种中,直接影响天牛的取食和消化,甚至杀死害虫。win3基因编码产物类似白薯或豆类胰蛋白酶抑制剂,李强等(1999)从欧洲黑杨(Populusnigra)和美洲黑杨中扩增出win3基因启动子WINP和WIDP,两者分别控制的GUS基因表达具有因伤诱导的效应。梁文星等(2006)运用RT-PCR方法从新疆杨(Populusalbavar.pyramidalis)叶片中克隆到1个损伤诱导型Kunitz胰蛋白酶抑制剂基因PaTI1。原核表达实验表明,纯化后的融合蛋白对胰蛋白酶的活性有抑制作用,每8.5μg融合蛋白可完全抑制1μg牛胰蛋白酶的活性,可有效减弱或阻断蛋白酶对外源蛋白质的水解作用。2.4选育抗冻基因的手段冷适应蛋白是低温诱导表达的一类特殊蛋白质。林士杰等(2006)从柽柳cDNA文库中分离得到冷适应蛋白基因ThCAP片段,并应用RACE技术获得其全长cDNA序列。Guo等(2009)在进一步的转基因研究中,获得转基因(35S::ThCAP)山新杨(Populusdavidiana×Populusbolleana),转基因植株对低温的抵抗能力明显增强,证实ThCAP是一个重要的耐寒基因。甜杨(Populussuaveolens)冷诱导基因ICE1的编码产物ICE,是在低温时诱导抗冻因子CBF家族表达的转录激活因子,可特异性结合CBF3启动子的MYC作用元件,启动CBF3基因的表达;然后CBF3转录激活因子再结合到其下游目的基因启动子的DRE/CRT序列上,诱导抗冻基因COR的表达,从而提高植株的抗冻性(林元震等,2007)。Lin等(2005)对甜杨PsG6PDH基因的原核表达实验表明,受1mmol·L–1IPTG诱导4小时,融合蛋白具有可溶性,且没有向细胞外分泌,表明该基因在维持细胞渗透势、参与抗冻胁迫中起重要作用。我国西部和北部的广阔区域长期面临严重的缺水威胁。如何从林木自身分离优良抗旱基因,用于抗旱耐盐节水新品种的培育,解决西部和北部干旱半干旱地区大面积造林问题,已成为当前需要完成的重大课题。国内专家对此展开了一系列研究。Chen等(2009)从旱生树种胡杨(Populuseuphratica)中分离到脱水响应结合元件PeDREB2,转基因烟草对盐生环境的适应性得到改善,同时其生长没有受到影响。Wang等(2009a)从白桦cDNA文库中克隆了编码区长度为750bp的抗坏血酸过氧化物酶APX基因,荧光实时定量PCR分析显示,在盐胁迫状态下,APX被高丰度诱导表达,可能参与白桦的抗盐机制。张守攻等(2006)将小叶杨(Populussimonii)胆碱单氧化物酶基因CMO整合至杂种落叶松(Larixleptolepis×L.olgensis)基因组中,基因表达和功能检测证实,杂种落叶松的抗旱能力得到了明显的提高。这些研究对阐明林木抗旱或耐盐机制,实现转基因林木抗旱新品系的选育有重要价值。在遭遇环境胁迫时,树木依赖抗氧化防御系统,防止膜脂过氧化作用和清除超氧阴离子的攻击,从而保护植株自身免受活性氧的伤害。王丙锋等(2007)利用RACE技术从柽柳中获得MnSOD的cDNA全长序列,转化至酵母基因组后,重组酵母的抗干旱、抗高温能力均明显高于对照非重组酵母。重金属是造成土壤和水系统污染的重要因素,利用林木对重金属进行吸收和转运,能有效降低土壤重金属的含量,达到环境修复的目的。张艳等(2007a)将柽柳的金属硫蛋白基因MT2连入载体pROKII,抗性实验证明,转基因烟草对Cd2+的抗性显著提高。另外,将柽柳金属硫蛋白基因MT1导入烟草,发现在含有200μmol·L–1和400μmol·L–1Cd2+的MS培养基上,过量表达MT1转基因烟草的株高和鲜重均明显优于非转基因对照植株,且叶绿素含量和SOD活性明显增加,表明MT1是一个介导Cd2+胁迫抗性的优良基因(张艳等,2007b)。3基因克隆及应用趋势目前,由于对不同树种遗传背景的了解程度有差异,因此需要选择性地采取不同克隆方法和策略。如果已知目的基因的全部或部分序列,可通过电子克隆、RACE或染色体步移技术分离基因全长。也可以针对已知目的蛋白的某些氨基酸信息,设计合适的寡核苷酸探针(库),通过与含该基因信息的基因组文库或cDNA文库杂交,分离编码此蛋白的DNA序列或cDNA片段;或设计目的蛋白的特异抗体与靶蛋白专一结合,从基因表达文库中分离目的蛋白基因。对于不同组织、器官中不同胁迫状态下差异性表达的基因,可以选用差异显示反转录PCR(DDRT-PCR)、RNA指纹技术(RAP-PCR)和外显子捕获等克隆方法。当目标基因的时空表达没有差异,或没有任何表达功能信息时,常采用构建文库直接测序、图位克隆法或转座子标签法等实现目标基因的克隆。总体上看,林木材质形成、开花调控和抗旱相关的基因克隆研究有一定基础,但抗冻、抗病虫害、抗环境污染等方面的研究还很薄弱。我国林木资源虽然丰富,但缺少对速生、优质、抗逆等优良特性的乡土树种的发现和挖掘,这直接造成了与林木优质高抗相关的主效基因的匮乏。已经克隆获得的林木抗逆功能基因,没有迅速有效地进行遗传转化并加以利用。另外,基因克隆的方法单一,绝大部分目标基因的分离仅限于RT-PCR和RACE技术,高效实用的新方法如TAIL-PCR、MOPAC、cDNA捕捉法等并未得到广泛应用。此外,在克隆策略的选择上针对性不强,盲目地进行目标基因的大通量分离,反而容易事倍功半。目前,林木转基因主要采用农杆菌侵染法和基因枪法。前者易发生单拷贝或低拷贝的转化事件,而且不适于银杏、杉木、松柏类等树种的遗传转化;后者的转化效率同样不高,且轰击过程中可能造成外源基因的断裂,导致插入基因失活。目前报道的转基因手段还难以做到将转入的基因定点、定量地整合到宿主基因组中。在植物表达载体的构建中,大多数使用CaMV35S组成型启动子,对诱导型启动子或组织特异型启动子欠缺考虑。外源基因导入植物细胞后,插入到不同的染色体,整合到不同的DNA区段(整合位点),而且整合的拷贝数和次数也有不同。发生整合的基因是否具有完整性及是否影响到整合位点的DNA结构,在林木中是否同样遵循孟德尔遗传规律,以及外源基因在林木子代中传递的稳定性等,这些都可能直接影响外源基因功能的鉴定和验证。利用基因工程技术对林木进行改良,虽然已取得飞速的发展,并展现着诱人的发展前景,但不能因此取代常规育种,新种质的创造、新品种的选育有赖于两者的有机结合。针对林木本身的特点和研究现状,我们认为今后在林木基因克隆及应用方面需加强以下几个方面的研究。(1)选择更新更强的组织特异型启动子或诱导型启动子,控制转入基因的表达量、表达时间和表达部位。在木材发育研究中,利用林木中分离的PAL、CAD、CCoAOMT、4CL、pProNAC068等维管组织特异启动子代替35S启动子,驱使靶基因特异性地在维管组织中表达,可以避免持续、高效表达造成的能量损耗和转基因安全性问题(Feuilletetal.,1995;Gray-Mitsumuneetal.,1999;Chenetal.,2000;Luetal.,2004;Bedonetal.,2009;贺郭等,2010)。另外利用抗逆(如抗病)相关顺式作用元件人工构建理想启动子,在农作物抗病研究中已开始起步(GurrandRushton,2005),在林业中未见相关报道。(2)通过正向遗传学方法,构建林木例如模式树种杨树的突变体库(张勇等,2006),分离主效基因。利用基因捕获、T-DNA标签(农杆菌介导的T-DNA插入)、转座子插入、RNAi、基因敲除等手段构建杨树基因突变体库,造成单个基因或基因家族的功能抑制、缺失或激活。根据单株表型鉴别、理化和材性分析等手段,鉴定和克隆关键的主效基因。在后续的研究中可以开展基因的功能互补实验,以进一步验证目标基因的功能。目前,拟南芥突变体诱导和大规模的突变体库筛选已实现完全自动化。国外正有效地开展树木突变体库的研究,国内对此的关注度不太高,因此需要在该领域加强研究。(3)选择新的克隆方法。基于表达序列标签(expressedsequencetag,EST)方法的基础,近几年基因表达系列分析技术(serialanalysisofgeneexpression,SAGE)得到了发展和完善,能够分离差异表达的基因,并对上千个转录产物进行定性和定量分析,并在火炬松木质部轴向梯度发育的差异基因表达研究中得到应用(LorenzandDean,2002)。靶向克隆法是一种新的基因克隆方法,其使用新开发的靶向克隆酶LPRecco,能够使末端序列相同的双链DNA(14–18bp)同源重组,从而达到连接克隆基因和载体的目的(俞远东等,2009)。基因表达指纹图谱(geneexpressionfingerprinting,GEF)利用含有标记末端的片段经凝胶电泳后构成的mRNA指纹图谱,分析不同细胞间的指纹图谱从而得到差异表达的序列(IvanovaandBelyavsky,1995)。另外,cDNA3′端限制酶切片段显示(restrictionfragmentdisplay,RFD)技术、分子指数的RNA指纹技术和标签接头竞争PCR技术(ATAC-PCR)等在人类、酵母、作物等的基因克隆和表达研究中有一定的应用(PrasharandWeissman,1996;Kato,1996,1997)。这些较新的克隆方法可以试探性地用于林木基因的分离和表达研究中。(4)导入转录因子基因,提高抗逆性。一个抗逆转录因子基因可以调控下游一批与抗逆相关的功能基因的表达。在这方面对于农作物的研究已进行得比较深入,DREB、CBF、ERF等优良的转录因子基因已实现有效转化(Itoetal.,2006;Chenetal.,2007Tangetal.,2007)。林木中虽然克隆了EguCBF1a、EguCBF1b、ICE1、PaDREB2、AP2/ERF、PhCBF4a和PhCBF4b等抗逆转录因子基因(家族)(Nanjoetal.2004;Qinetal.,2005;Kayaletal.,2006;林元震等2007;Wangetal.,2008b),但还未见转基因成功的报道,因此基因转化的研究力度需要进一步加大。(5)建立多基因转化体系。抗虫、抗病等性状大多是由多基因控制的,单个基因的导入在抗虫、抗病性状改良中起的作用微小,且害虫易对单个抗性基因产生耐受性。解决问题的有效途径有2条。(1)将多个目标基因直接融合或用调控元件隔开构建在1个表达载体中。例如Chen等(2006a)利用gateway技术构建了含有7个外源基因片段的多基因表达载体,并成功实现遗传转化,但在林业中还未见此类报道。(2)将多个单价基因分别构建在多个表达载体上,利用基因枪等方法实现共同转化。如王建革等(2006)将含有5个外源基因的4个表达载体成功导入库安托杨(Populus×euramericana‘Guariento’),中试实验表明,多数转基因植株生长状况良好。后一种共转化途径的共整合频率和共表达频率可能比前者要低。(6)完善核酶基因操作和基因转化技术。核酶指具有催化功能的RNA分子,能够完成自身的剪接反应。据此可设计、合成特异性切割病毒RNA的核酶基因,导入植物中以验证抗病毒侵染的性能。该技术已在番茄(Solanumlycopersicum)和马铃薯(Solanumtuberosum)的抗病研究中得到应用(朱秋菊,2005;张剑峰等,2008),但在林木研究中还未见相关报道。质体基因转化在近年来应用广泛,成为新的研究热点。叶绿体转化体系利用叶绿体的同源片段将外源基因定点整合到植物的叶绿体基因组中,通过其高拷贝性实现外源基因的高效表达,在烟草、大豆(Glycinemax)、胡萝卜(Daucuscarota)和棉花