肿瘤的分子诊断 完整版

肿瘤的分子诊断2第一节肿瘤的分子诊断一、肿瘤的发病机制(还不清楚)多阶段：增生→非典型增生→原位癌→早期浸润癌→中晚期癌多因素：多种致癌因素,环境因素和遗传因素相互作用多基因：原癌基因激活、抑癌基因失活、凋亡调控基因的改变、DNA修复基因失活3２.基因变异-肿瘤发生的内因

肿瘤发生机理癌基因的激活

抑癌基因的失活6（１）癌基因oncogenes

细胞基因组中具有能够使正常细胞发生恶性转化的基因Cellularoncogenec-oncViraloncogenev-oncProto-oncogene,activatedbymutationtoc-onc癌基因在正常细胞的基因组中存在不表达状态表达水平不足以引起细胞的恶性转化7１）生长因子类Growthfactor

此类癌基因蛋白质产物与某些生长因子结构相似，通过自分泌，刺激细胞过度增殖而导致癌．包括SIS(PDGF)，int-2(FGF)，FGF-3等8２）酪氨酸激酶类跨膜蛋白erbB1,erbB2／HER-2,EGFR膜结合蛋白ablsrc-1Growthfactorreceptor

e.g.tyrosinekinasereceptors10３）GTP结合蛋白膜结合蛋白H-ras,K-ras,N-rasRas能水解GTP为GDPRas氨基酸12，13，61为点突变降低水解酶活性，使ras持续活化ras11４）核蛋白类Nucleartranscriptionfactors转录因子e.g.MYCmycmybfosjun肿瘤扩增12５）端粒端粒(telomere)是位于细胞染色体末端的一种有2-20kb串联的短片段重复序列(TTAGGG)n及一些结合蛋白组成的特殊结构。13５）端粒酶端粒序列的复制依赖于端粒酶（telomerase）端粒酶为一种特殊的DNA聚合酶,由RNA和蛋白质组成的核糖核蛋白复合物(RNP)，含有端粒重复序列的模板，即以自身RNA组分为模板，复制合成端粒序列。14人的端粒长度约15kb，随着细胞的每次分裂，逐渐缩短，每次丢失50-200个核苷酸。端粒的缩短限制了细胞增殖能力，对端粒长度的计算是计数细胞分裂次数的生物钟。15（２）癌基因的活化机制１）转导漫长进化过程中,逆转录病毒感染正常细胞,通过重组将细胞的原癌基因整合入病毒基因组,使原癌基因活化.带有此种基因的病毒感染合适的动物时,可使其发生肿瘤.转座逆转录转录RetrovirusRNA转导－逆转录病毒16２）点突变

17３）插入突变逆转录病毒本身不含有癌基因,但是当其插入宿主细胞原癌基因邻近,使原癌基因活化.18４）易位

染色体出现易位、重排等改变时，可使细胞癌基因与正常的抑制子分开而被置于活化DNA序列的控制之下，其中具有代表性的例子为Burkitt淋巴瘤。19AcuteMyelogenousLeukemiaiscausedbythistranslocation2021５）基因扩增DNA拷贝数增加形成双微体(DM)和均染区(HSR)22６）甲基化改变1.癌基因去甲基化,抑癌基因高甲基化.2.甲级化致突变：脱氨基作用是DNA自发损伤的一种普遍形式，未甲基化的胞嘧啶脱氨基产物是尿嘧啶，细胞内的尿嘧啶DNA糖基化酶特异性识别U:G错配，能及时修复DNA突变。而5-甲基胞嘧啶的脱氨基产物胸腺嘧啶（T）是一正常的DNA碱基，此时尿嘧啶DNA糖基化酶的修复作用丧失，最终导致基因突变的存在.23（２）癌基因的活化机制总结24（３）抑癌基因定义:一对等位基因由于其功能丧失,从而使细胞过度增殖,导致肿瘤的形成,这对等位基因即为抑癌基因.特点：1.癌细胞中一对等位基因同时失活;

2.能够抑制细胞恶性转化或抑制细胞异常增殖的基因.目前研究较多的有p53基因、RB基因、p16蛋白、p15蛋白、p21等。25１）Ｒb基因视网膜母细胞瘤(RB)易感基因,定位于13q14.两个等位基因缺失或一个等位基因缺失,另外一个因突变而失活,造成RB基因功能丧失.基因产物及功能:p105，控制生长.RB基因功能丧失常见肿瘤:RB、成骨肉瘤、胃癌、SCLC、乳癌、结肠癌.2627２）p53定位与17p13,11个外显子组成,393个氨基酸.蛋白有5保守区,分别位于13-19,117-142,171-192,236-258,270-282位氨基酸.肿瘤突变大多发生在这些保守区.野生型p53(wtp53)半衰期为20分钟,而突变型p53（mp53）半衰期为1.4-7.0小时．

p53突变常见相关肿瘤:星状细胞瘤、胶质母细胞瘤、结肠癌、乳癌、成骨肉瘤、SCLC、胃癌、磷状细胞肺癌28野生型P53生物学活性当DNA损伤的时候,P53基因就明显表达使细胞在G1期生长阻滞，修复DNA;或不能修复,促使细胞凋亡。抑制肿瘤细胞生长保持DNA完整性29

p53P53p21BAX303)APC基因APC基因克隆自腺瘤性多发性息肉病(adenomatouspolyposiscoli,APC)，定位于5q21，编码2842个氨基酸．APC的功能：促进癌基因β-连环蛋白(β-catenin)的降解抑制肿瘤的形成．APC失活导致细胞增殖乃至恶性转化．APC失活见于：腺瘤性多发性息肉，散发性结直肠癌，肺癌等肿瘤．314)BRCA1BRCA1是乳腺癌易感基因１(breastcancersusceptibilitygenetype1,BRCA1),是遗传性乳腺癌／卵巢癌综合症的易感基因．定位于17q12-13，含22个外显子，编码1863个氨基酸．BRCA1功能：基因转录调控，DNA损伤修复．失活引起基因组不稳定．BRCA1基因突变或杂和性丢失，导致其失活，常见于乳腺癌和卵巢癌．325)p16INK4ap16INK4a是INK4(inhibitorofCDK4andCDK6)基因的一种蛋白产物，是一种细胞周期抑制蛋白(CKI)功能：p16INK4a与cylinD1竞争结合G1期激酶CDK4／CDK6，抑制其对Rb蛋白的磷酸化，结合转录因子E2F-1，结果依赖E2F-1转录的基因不能转录，从而抑制DNA合成，阻止细胞分裂．33p16INK4a胰腺癌，非小细胞肺癌，神经胶质细胞瘤，急性白血病，鼻咽癌常见p16INK4a基因纯合性缺失．食管鳞癌，胆管癌常见p16INK4a基因突变．大肠癌，乳腺癌常见p16INK4a基因启动子部位CpG岛高甲基化．34６)p21p21是一种广泛细胞周期激酶抑制蛋白．功能：p21与多种cylinD／CDK复合物结合，使其丧失磷酸激酶活性，使pRb不能磷酸化，从而使细胞周期停止在G1期；还与PCNA（细胞核增殖抗原）结合，抑制其与DNA聚合酶结合，抑制DNA合成．（１）依赖p53途径．DNA受损，p53上调，诱导p21表达上升．（２）非依赖p53途径．生长因子（EGF，FGF，PDGF等）通过细胞分裂素活化的蛋白激酶（MAPK）途径上调p21表达．多数肿瘤见其表达异常（尤其黑色素瘤），未见其突变．35７)其他抑癌基因WT1１WT1：肾恶性胚胎瘤易感基因，负调控转录因子，常表现为杂合性丢失．２DCC（deletedincolorectalcancer,DCC)：结直肠癌缺失基因，其缺失与结直肠癌进展有关．３PTEN:抑制肿瘤细胞酪氨酸激酶FAK活性，抑制肿瘤细胞生长．通常以杂和性缺失，基因突变，甲基化改变见于多种肿瘤（乳腺癌，卵巢癌，肺癌，肾癌，膀胱癌等）363.表观遗传学的改变表观遗传学：即不是指DNA质与量的改变，而是DNA修饰改变，如甲基化改变，乙酰化改变，小RNA(microRNA)调节．很多抑癌基因的失活是甲基化表观遗传学改变和突变，缺失等遗传学改变联合作用的结果．374.DNA损伤及其分子改变1物理化学因素（紫外线，电离辐射，致癌物）．２DNA分子自发改变发生于DNA复制，DNA修复，基因重排过程中，DNA分子自身的化学改变而导致的水解，氧化和甲基化．385.基因组不稳定性

正常基因组保持惊人的稳定性和完整性，反映高保真复制基因突变积累到一定程度，造成染色体畸变，从而造成染色体不稳定．396.染色体异常染色体的结构的改变40染色体数目的改变1）整倍体多倍体;具有两套以上的染色体三倍体：具有三套染色体2)非整倍体：增加或减少一条或几条染色体417微卫星不稳定性微卫星DNA指简单重复序列(1-4bp),在体内是不能表达的。原位杂交实验表明，卫星DNA定位于染色体的异染色质区，与染色体着丝点相连。肿瘤表现为简单重复序列的增加或丢失．结肠癌，胃癌，肺癌，胰腺癌ＰＣＲ检测肺癌-分子诊断42MolecularsubsetofNSCLC(10~16.6%)(19~21%)(5%)(1.9%)(forHER2,Shigematsu,CancerRes2005)RET(1~2%)肺癌—基因诊断和个体化治疗45EGFRT790M~250kb~300kbt(2;5)ALKgenebreakpointregion2p23regionTelomereCentromere3’5’Shawetal.,JCO,inpressBreak-ApartFISHAssayforALKFusionGenes

54结直肠癌分子模型56３乳腺癌（１）BRCA1，BRCA2基因突变：家族性乳腺癌患者．（２）抑癌基因：p53，PTEN突变（3）癌基因：c-erbB2，c-myc（扩增），

nm23（肿瘤转移抑制基因，ＬＯＨ）57白血病:染色体易位和重排影响分子病理诊断的关键因素•良好的标本组织•严格的质量控制•规范的实验操作•适当的技术选择•结果的可靠验证59分子诊断在肿瘤诊断中注意事项用于肿瘤早期诊断或癌