草莓重茬病菌的分离鉴定

草莓重茬病菌的分离鉴定

“重农病”是指同一地块内连续种植相同品种的育种、第二阶段后的生长发育不良和病，导致产量和品质严重下降的现象。草莓重茬地发病率可达89.2%,目前主要采用溴甲烷熏蒸的方法进行防治,造成了严重的环境污染。有报道指出,草莓重茬病的发生是由于土壤微生态环境恶化造成的,因此,有针对地研制土壤微生态调节剂,从调控土壤微生态环境入手解决草莓重茬病可能是一种很有研究前景的控制措施。目前,许多学者进行了利用微生物防治草莓重茬病害的研究,但是国内外尚无利用木霉防治草莓重茬病害的报道。木霉(Trichoderma)是一类分布广泛、具有重要利用价值的拮抗性土壤习居真菌,对多种病原菌具有拮抗作用。本研究的目的是对草莓主产区连作地块的重茬病菌进行分离鉴定并研究木霉对草莓重茬病的防治效果。1材料和方法1.1材料表面1.1.1草莓品种的选择草莓病株从河北省8个草莓连作区选取,田间试验采用丰香品种的草莓;菌种:镰刀菌(Fusarium)、立枯丝核菌(Rhizoctonia)草莓病株上分离,T42木霉(Trichoderm)本试验室分离保存。1.1.2国际h4-2so4模型葡萄糖,分析纯,石家庄试剂厂;琼脂,分析纯,SanlandInternationalInc;(NH4)2SO4,分析纯,北京化工厂;KH2PO4,分析纯,天津市化学试剂六厂;CaCO3,分析纯,石家庄试剂厂;蔗糖,分析纯,上海试剂总厂。1.1.3仪器生化培养箱。1.1.4发酵培养基PDA培养基用于病原菌的分离及平板抑菌试验,木霉的液体发酵培养基为:麸皮0.5,(NH4)2SO40.2,KH2PO40.1,CaCO30.1,蔗糖1,水1000,pH5.5～6.0。木霉制剂:由木霉发酵物辅以适量草炭。1.2方法1.2.1消毒时间取所取发病植株根部,70%酒精表面消毒2min,0.1%升汞消毒1min,无菌水冲洗3次。取病健交界处,剪成长度0.3cm小段,放入盛有PDA培养基的平皿中,每皿3段,25℃恒温培养,待菌落长出后,统计各菌落出现频率,纯化并进行分类鉴定。1.2.2草莓苗病害观察方法:对所分离病原菌进行纯化培养,将培养物制成108cfu/ml的孢子悬浮液,将草莓苗根部在其中浸泡15min,然后栽入直径为15cm盛有等量灭菌土的花盆中,每处理10次重复,温室培养30d,观测并记录其发病情况。1.2.3木霉t-pda平板制备将活化的木霉斜面菌种接种于木霉液体发酵培养基,于28℃、250r/min摇床,培养72h。木霉发酵液4000r/min离心20min,取上清液。在倒PDA平板之前,将原液、10倍稀释液、100倍稀释液按1∶10的比例与PDA培养基混合,然后将直径0.9cm病原菌菌块接入平板的边缘,以加入清水的培养基为对照。测量对照中病原菌菌落满板时,各处理的菌落半径。1.2.4田间实验设计本实验在栾城县范台村,分别于2002～2003年度、2003～2004年度两个年度同时进行盆栽和田间实验,连作土为对照,以木霉菌剂(15g/kg土)为处理。每处理3次重复,田间实验随机排列,小区面积20m2,栽培管理与田间相同。草莓生育期间测定不同生育时期的草莓株高、茎粗、草莓开花时期、草莓果数、果重及生物量。2结果与分析2.1牧草重农病原生植物的分离与测定2.1.1单梗双胞霉、拟盘多毛孢分离频率表2列出了分离频率较高的5种真菌,通过对菌落生长速度、培养性状、色泽、产孢类型、菌丝形态等测定及观察,鉴定5种真菌分别为Fusariumoxysporun(尖孢镰刀菌)、Rhizoctoniasolani(立枯丝核菌)、Verticilliumdahliae(大丽轮枝菌)、Didymariacda.spp(单梗双胞霉)、Pestalotiopsissteyspp.(拟盘多毛孢),从表2可以看出,尽管不同地块的分离结果有一定差异,但均以镰刀菌和丝核菌的分离频率比较高,而单梗双胞霉、拟盘多毛孢不同地块的分离频率差异很大。表3列出五种真菌对草莓致病性测试结果,镰刀菌、丝核菌和轮枝菌均能浸染草莓,引起病害,植株症状和田间病株一致,并且从发病植株根部能再分离获得与接种物相同的培养物,说明这三种菌为草莓重茬病的主要病原菌,其他两种真菌不能浸染草莓,可能是由于他们具有腐生于草莓病根的能力,所以在有些地块也具有较高的分离频率。2.2木霉t42发酵汁的抑制率由表4可知,T42木霉发酵液对立枯丝核菌和尖孢镰刀菌的生长产生明显的抑制作用,其中10倍T42木霉发酵液对立枯丝核菌和尖孢镰刀菌的抑制率分别为87.8%、85.3%,1000倍的抑制率也能达到37.0%和31.0%。由此表明,T42木霉对病原菌有明显的拮抗作用,可以作为潜力生防菌株。2.3木霉菌涂料对双重田园感染的稻草栽培的预防2.3.1木霉对不同浓度木霉处理的生长情况木霉菌剂对草莓生长有一定的促进作用,由图1可以看出,木霉处理的株高、茎粗、生物重等指标均优于重茬对照。分析推知,木霉能够对病原菌的生长繁殖起到抑制作用,从而减轻其对草莓的危害,有利于连作草莓的生长发育。2.3.2对草莓死苗率的影响第一批果实采收之后,由于植株体内营养消耗增多,造成营养供应不良出现死苗是草莓重茬病的重要病症。由图2可知,连作土壤中施入木霉菌剂明显降低了连作草莓的死苗率,草莓第一批果采收之后,对照和处理都出现了死苗现象。显著性分析表明,连作处理死苗率52.9%极显著地高于木霉处理,表明木霉菌剂施于土壤,可减轻草莓重茬死苗的发生,起到控制重茬病害的作用。2.3.3开花期、收获期提前表5列出不同处理草莓的重要生育期,从表中可以看出,木霉处理能够使连作草莓的生育期提前,其中开花期提前4天、收获期提前6d。由表6可知,施入木霉不仅使重茬草莓的收获期提前还能够增加草莓的产量,显著性分析表明,总产量之间存在极显著差异。3土壤微生态调节剂的应用实验通过对连作草莓根部真菌病害的研究,证实了草莓重茬病主要是由3种病原真菌单独或复合侵染引起的,经进一步鉴定3种病原真菌分别为:FusariumoxysporumSchl.f.sp.fragariaeWiinksetWillams、RhizoctoniasolaniKuhn、VerticilliumdahliaeKelb。在河北省草莓产区以镰刀菌和丝核菌的单独和复合侵染为主。草莓重茬病发生的原因,可能是由于连作条件下草莓根系分泌物或残茬腐解物在土壤中逐年积累,这些物质为土壤中病原真菌的繁殖提供了条件,使其种群数量增加,最终导致病害严重发生。目前,草莓重茬病害主要利用溴甲烷进行防治,溴甲烷被禁用后用何种方法控制草莓重茬病害是当前亟待解决的重要问题。甄文超等人研究表明连作土壤微生物种群变化的原因应是草莓再植病害发生的主要原因之一,因此利用土壤微生态调节剂,从调控土壤微生态环境入手解决草莓重茬病可能是一种很有研究前景的控制措施。马宝红等报道两种VAM菌对草莓病害有明显的防效,高志华等人利用丛枝菌根菌与太阳热消毒配合对连作草莓病害进行防治,相对防效达53.31%。而徐淑