应用pcr及nesedpcr检测柑桔木虱及其寄主九里香

应用pcr及nesedpcr检测柑桔木虱及其寄主九里香

脐橙是世界上最具毁灭性的食品疾病。除中国以外，它还深受东南亚、南亚、非洲东南部和阿拉伯半岛的影响。它是由难培养的韧皮部杆菌属(Liberobacter)的一种细菌引起的。根据它的病原特性,可分为二个种:亚洲种(L.asiaticun)和非洲种(L.africanum),其传播媒介分别为亚洲木虱(Diaphorinacitri)和非洲木虱(Triozaerytreae)。在我国,柑桔黄龙病已成为制约柑桔生产的主要病害。亚洲木虱的成虫及高龄若虫均可传病,集团或单个木虱成虫均能传病。病原在木虱体内循环期最短为1d,长的为27d。柑桔黄龙病的田间传播和流行与木虱的带菌及其活动有十分密切的关系,因此对木虱的研究亦成为黄龙病防治研究中的一个重要环节。以往对它的研究多采用饲菌木虱接种系列柑桔幼苗与电镜观察相结合的方法,费时且灵敏度较低。随着PCR技术的兴起,利用PCR技术可快速检测和定量分析柑桔黄龙病及其病原的浓度,并利用NestedPCR进一步检测尚未表现症状的黄龙病病株。NestedPCR的原理,即首先在常规条件下用第一套跨越目的DNA片段的引物扩增,接着对一部分反应物-产物混合物进行新的一轮扩增,采用的引物与第一套引物的产物内侧的序列配对。在此轮扩增中,只有目的产物继续被扩增,其灵敏度可检测到106基因组DNA背景下一个拷贝的病毒基因。作者对其稍做改动,先设计一套563bp的长引物(P1,P2),进行常规PCR扩增,再用一套介于563bp内的短引物(P3,P4)进行第2次扩增,其效果亦十分理想。九里香(Murrayapanciculata)是芸香科植物,是柑桔木虱的常见寄主。由于其植株叶片不表现柑桔黄龙病的斑驳病状,且它的叶脉切片在电镜下未能观察到筛管细胞中有病原的存在。人们怀疑它可能是黄龙病病原寄主,但尚未找到直接依据。利用PCR技术,特别结合NestedPCR的技术,对木虱及九里香进行了详细的研究,结果如下。1材料和方法1.1木锑的饲养及接种感病芦柑植株:田间发病的黄龙病病株移栽在防虫网室中,树龄3年。健康木虱:田间木虱转饲九里香实生苗,待卵孵化即转入新九里香实生苗培养的木虱成虫,即为健康木虱,因为黄龙病病原不会通过卵传递给新一代若虫。健康木虱在芦柑病株上饲菌1、2、3、5、10d,测定木虱获得病原最短的饲菌天数。健康木虱在芦柑病株上饲菌20d以上后,分别测定单虫和不同数目的木虱的带菌检出率,以及转饲接种1、2、3、5、7、10d的九里香实生苗,测定带菌木虱能否将病原传到九里香上及其最短的接种天数。同时,用带菌木虱分别接种芦柑实生苗1、3、5、7d,作为正对照。田间木虱:1999年初至10月间,在闽候窗下乡遭受黄龙病严重危害的雪柑园(发病率50%以上)、福州城门乡中等发病的柑桔园(发病率20%～50%)和轻病的柑桔园(发病率20%以下)分别采集的木虱成虫样本。同时,在福州市采集作为行人道观赏植物的九里香样本及其上的木虱样本。1.2引物的设计与合成PCR试剂中各种试剂(Tag酶,10XPCRbuffer,dNTP)购自华美公司。引物P1(TCT-GITTTTCTTCGAGGTTGGTGA)、P2(ACCGCAAGACTCCTTACCAGGAAG)是根据柑桔黄龙病病原亚洲株系的DNA序列(基因序号码为94319)自行设计,既可用于常规PCR检测,亦可用于NestedPCR的第1次扩增,而用于NestedPCR中第2次扩增的引物P3(GCGTTCAT-GTAGAAGTTGTG)、P4(CCTACAGGTGGCTGACTCAT)是引用Deng等的设计,两对引物由上海生物工程公司合成。分子标记为SIGMA公司的产品,100bp分子量标记。PCR仪是PE公司的9600型,其它试剂均为国产分析纯。1.3ss-pcr法检测dna病原DNA的提纯:方法为碱裂解法,并作部分改动。将木虱放入100μleppendorf管中,九里香叶脉0.5g剪碎后置于研钵内,加入50mmol/LTris-HCl,10mmol/LEDTA(pH8.0),浸没即可,磨烂后,14000r/min瞬间离心,取上清加入等体积0.2mol/LNaOH+1%SDS,摇匀,冰浴10min,加入等上清体积NaAc(pH4.8),摇匀,冰浴5min,14000r/min离心5min,取上清加入2～2.5倍无水酒精,-84℃30min,14000r/min离心20min,沉淀用75%、95%酒精各洗1次,吹干,DDW溶解。PCR与NestedPCR检测:取0.4～1.0μgDNA,反应体积为50μl/管,在下列条件下进行PCR:94℃预变性2min,94℃变性30s,60℃退火1min,72℃延伸1min。反应35个循环后,72℃再延伸10min。首先用P1,P2进行第1次扩增,再取上述扩增产物5μl,用P3,P4再扩增1次。扩增产物用1.5%的琼脂糖电泳,紫外灯下观察并在凝胶成像仪下照相。2木锡木病检测结果2.1PCR检测采用PCR(引物为P1、P2)检测不同数目的饲菌木虱的结果表明,2、3、5头饲菌木虱在563bp处有明显扩增带,健康木虱和1头饲菌木虱则均观察不到扩增带。2.2NestedPCR检测NestedPCR检测不同数目的饲菌木虱的结果表明,除健康木虱外,1、2、3、5头饲菌木虱在400bp处有明显扩增带(图1)。通过对100头单个带菌木虱进行检测,共计扩增4次,单虫带菌检出率为96%,说明NestedPCR有很高的重复性。在芦柑病株上依次饲菌1、2、3、5、7d的单个木虱,检测的结果均有扩增带(图2)。这与以前研究的结果一致,单个木虱在病株上饲菌1d便可获得黄龙病病原。从闽候窗下乡重病园、福州城门乡中病园及附近轻病园采集的木虱各100头,检测其带菌率依次为87%、53%、21%。这表明黄龙病在田间的传播与木虱虫口密度,特别是带菌木虱的虫口密度之间有十分密切的关系。检测饲菌木虱接种九里香实生苗的结果表明,接种1、2、3、5、7、10d的九里香叶片均有扩增带,而未接种的则没有扩增带(图3)。同时,饲菌木虱接种芦柑实生苗1、3、5、7d的正对照检测结果表明,除健康芦柑外,全部芦柑叶片均有扩增带(图4)。这和以前研究的结果一致,单虫在芦柑上接种1d便可传病。检测城市九里香及其上的木虱的结果表明,城市九里香及其木虱样本均有扩增带,作为正对照的带菌木虱接种的九里香实生苗和饲菌木虱样本亦有扩增带;而健康九里香实生苗和健康木虱则均无扩增带。3面解漏检的检测近年来,随着生物技术的飞速发展,PCR技术也应用于研究柑桔黄龙病,但多运用在病原菌研究上。对木虱的研究仍局限在常规方法,既费时又欠准确。利用NestedPCR技术对柑桔木虱及其寄主九里香的研究,得出以下的初步结论。NestedPCR技术的灵敏度比PCR的高,可以检测出末表现病状的病株。本结果与Deng等的报道是一致的。由于未表现病状的植株体内的病原菌浓度比表现病状的低,用PCR法检测常会产生漏检现象。用指示植物芦柑的生物检测法虽可解决漏检问题,但甚为费时。因为黄龙病的潜伏期可长达10～15月。所以,长期以来对柑桔苗木实行检疫的法律虽已公布,但因缺乏快速而准确的检测方法,实际上无法执行。NestedPCR技术的应用,将为柑桔苗木检疫提供可行的检测方法。NestedPCR克服了PCR难以检测出单个带菌木虱的困难,使对单个木虱的带菌率进行分析成为可能。通过对100头单个饲菌木虱的检测,获得其检出阳性率可达96%的结果。从窗下乡柑桔重病园(发病率为50%以上)、城门乡中等病园(发病率为20%～50%)和轻病园(发病率为20%以下)采集木虱检测的结果表明,木虱的带菌率分别为87%、53%和21%。所以应用NestedPCR对田间木虱带菌、寄主带病及其环境条件等方面的研究,可进一步探索病害流行与测报的问题。九里香是木虱最喜欢的寄主,又是福建、广东等省城乡常种的观赏植物。长期以来九里香是否为黄龙