烟草花叶病毒的诱变选育及交互保护作用研究

烟草花叶病毒的诱变选育及交互保护作用研究

由于松茸（tv）引起的卷烟花叶病是卷烟生产中最重要的疾病之一。利用弱势植物保护寄生虫避免感染同类型病毒的侧支是当前国内外病毒防治的热点之一。对于弱毒植物的获取方法很多。除了自然过滤外，还可以通过物理因素（如辐射、热处理）和化学因素（如亚硝酸）对强毒植物进行人工诱导。由于mtv的自然武变率低，难以获得弱毒植物，因此采用人工武变法可以快速实现突变目标。因此，mtv弱毒植物通常采用人工诱导和转化方法。在本实验中，通过处理、亚硝酸盐诱导和混合处理，对vmv强毒株进行诱导和筛选，并分析影响相互作用保护的因素。1材料和方法1.1试验材料1.1.1病毒毒源采自福建龙岩烟区的典型烟草花叶病株,经心叶烟连续4次单斑分离后,繁殖在普通烟上.1.1.2烟台草品种为普通烟品种(K326),由福建省大田县烟草公司提供.1.1.3抗血小板聚集抗血清TMV普通株系的抗血清由福建农林大学植物病毒研究所制备,用琼脂双扩散法测定其效价为1∶100.1.1.4种子和消毒供试鉴别寄主植物种子部分由厦门华侨亚热带引种植物园徐平东博士赠送,部分购自市场或采自野外.所有种子均用质量浓度为0.1g·mL-1Na3PO4消毒后使用.1.2强制改变方法1.2.1病汁液接种方法以分离纯化的TMV强毒株为材料,参照後藤忠则ら的方法,35℃热处理15-16d.以K3PO4缓冲液(1/15mol·L-1,pH7.2)100倍稀释(W/V)的病汁液接种心叶烟为对照.1.2.2硝酸处理参照郑贵彬等的方法,处理10-40min.1.2.3综合处理取35℃热处理15d的茎部,再经上述亚硝酸处理.1.3elisa法检测多态性烟株中的毒株和毒株记录小型单斑数和总斑数.单斑分离参照Yehetal的方法,1个单斑接种1株普通烟.观察20d,淘汰有表现症状的烟株,无症状的烟株用间接ELISA法检测.阳性反应的植株接种心叶烟复检,阴性反应的植株接种强毒株.1.4虚弱毒症的筛选1.4.1中毒的评估将经间接ELISA法检测确定为带毒但不表现症状的病株接种于心叶烟,单斑分离后接种普通烟,并观察其症状表现,以同样方法连续接种4代.1.4.2接种叶和系统叶参考覃秉益等方法,稍作修改.接种弱毒株时,第1次接种后隔10min左右重接1次.接种14d后用间接ELISA法检测植物的接种叶和系统叶,检测为阳性的植株继续观察症状的表现.1.5接种前和接种后取样强、弱毒株分别接种团棵期普通烟的第4叶位叶片,各重复3株.弱毒株接种方法同1.4.2.分别于接种前及接种1d后开始取样.接种部位包括接种叶和接种叶的上3位叶.取样方法:用直径为8mm的打孔器在重复的3株上各取1圆片,将3个圆片合在一起称重,按1∶10(W/V)加入包被缓冲液,-20℃保存,最后用间接ELISA法检测.1.6强、弱毒株增殖速率的测定采用正交设计法,以L9(34)方案安排试验,每组重复10株.考察因素包括弱、强毒株接种浓度,接种间隔时间,强毒株的接种部位及烟株生育期等.强、弱毒株的病叶分别用K3PO4缓冲液(0.1mol·L-1,pH7.2)100倍稀释(W/V),接种心叶烟,测定枯斑数,确定强、弱毒株的接种浓度.取强毒株浓度高于弱毒株浓度,强、弱毒株浓度相同及强毒株浓度低于弱毒株浓度3个位级.烟株生育期分为幼苗期、团棵期及成熟期.根据强、弱毒株增殖速率的测定结果,确定弱、强毒株的接种间隔时间,取弱毒株处于潜伏期、弱毒株增殖并输送到系统叶上及弱毒株在烟草植株中充分扩展这3个时间段.强毒株接种部位分别为弱毒株接种叶的上位叶、接种叶及下位叶.观察症状,接种强毒株30d后记录结果,统计病株率.2结果与分析2.1小型枯斑的诱变效果TMV的强毒株与弱毒株在心叶烟上可出现2种不完全相同的枯斑,前者为大型淡色枯斑,后者为小型枯斑,故以小型枯斑作为突变成弱毒株的标志,诱变结果见表1.未经诱变剂处理的N1/N2值为0.803;而35℃热处理、亚硝酸处理及复合处理的N1/N2值都有所提高,说明3种诱变处理都可以有效提高突变频率;而复合处理的N1/N2值与对照相比提高显著,较单独处理也有明显的提高,说明复合处理具有较好的协同效应.2.2虚弱毒症的筛选2.2.1带毒烟草植株的筛选单斑分离共接种了258株烟苗,20d后淘汰37株有表现症状的烟苗.用间接ELISA法检测不表现症状的烟苗,其中17株为阳性反应,15株陆续出现症状,只有代号为017、022的2个突变株表现相当稳定,即不表现症状.以间接ELISA法检测为阴性的烟苗接种强毒株,发现有1株连续2次均不表现症状,将其接种于心叶烟,有枯斑产生,其标号为152.选定标号为017、022、152的3个变异株进行毒力鉴定.连续反复接种心叶烟及普通烟4次,观察普通烟表现的症状,结果见表2.017和152连续4代在普通烟上均不表现症状,表明这2株的弱毒性稳定.而022的4代刚开始时均不表现症状,到后期(至少接种30d后)出现轻微花叶症状,表明其弱毒性不稳定.从而获得2株稳定的弱毒株,记为TMV-017(35℃热处理15d)及TMV-152(复合处理20min).2个突变株的带毒烟草植株与正常植株外观上无显著区别.因此热处理和复合处理均获得了稳定的弱毒株.2.2.2供试植物的筛选强、弱毒株共接种17科50种植物,包括茄科的辣椒、普通烟、白肋烟、心叶烟、三生烟、洋酸浆、番茄、龙葵、枯斑三生烟、蔓陀萝,豆科的绿豆、豌豆、花生、蚕豆、大豆、赤豆、豇豆、菜豆、菜豆(pinto),十字花科的白萝卜、包菜、花椰菜、青菜、芥菜、油菜,葫芦科的苦瓜、绞股蓝、丝瓜、甜瓜、黄瓜,车前科的大车前,菊科的苍耳、莴苣、马兰、野菊花,藜科的苋色藜,苋科的千日红、苋菜,紫茉莉科的紫茉莉,禾本科的玉米,旋花科的空心菜、甘薯、裂叶牵牛,凤仙花科的凤仙花,伞形科的芹菜,番木瓜科的番木瓜,商陆科的商陆,唇形科的紫苏,夹竹桃科的长春花.接种后的症状观察和间接ELISA法检测表明:在供试植物中,强、弱毒株主要侵染4科13种植物,在心叶烟、曼陀罗、枯斑三生烟、菜豆(pinto)、苋色藜、千日红的接种叶上均为局部坏死斑.强毒株在辣椒、普通烟、洋酸浆、三生烟、龙葵、白肋烟、番茄上为系统侵染,呈花叶症状,而TMV-017和TMV-152能侵染,但没有可见的症状.表明筛选得到的弱毒株并未扩大寄主范围,弱毒株的应用在这些植物上是安全的.2.3稳定性检测所用弱毒株为TMV-152.在接种叶上强毒株的阴性对照D(405nm)值为0.113,弱毒株TMV-152的阴性对照D(405nm)值为0.186(表3).采用ELISA方法检测病毒时,D(405nm)值/阴性D(405nm)值≥2,则判定检测结果为阳性.由表3可知:强毒株在接种后第2天该比值为4.894,而弱毒株在接种后第4天该比值为3.699,故为阳性反应,表明强毒株的增殖速率比弱毒株快.强毒株的比值稳定在8左右,而弱毒株的比值则远低于8,表明强毒株在烟草植株体内的浓度比弱毒株的高.在系统叶上,强毒株的阴性D(405)值为0.111,弱毒株(TMV-152)的阴性D(405nm)值为0.185(表4).由表3可知,强毒株在接种后第4天比值达到3.694,而弱毒株则在第5天达到2.222,故为阳性反应,表明强、弱毒株均已扩展到系统叶上.从接种叶和系统叶上的增殖速率看,弱毒株在烟草植株体内的运输并未受到影响.2.4团株期和接种间隔时间所用弱毒株为TMV-152.强、弱毒株分别接种心叶烟,枯斑数相差3倍,因而确定弱、强毒株接种浓度分(1/10,1/10)、(1/10,1/40)、(1/10,1/160)3个位级.弱、强毒株接种间隔时间分别取1、6、17d3个位级,4个因素的3个位级见表5.用L9(34)正交表安排试验,结果见表6.从表7可知,考察的4个因素中,强、弱毒株接种间隔时间的极差(R)最大,表明它们是影响弱毒株保护作用的最重要因素.在团棵期,弱、强毒株接种间隔时间为17d,保护效果最佳(病株率为0).3讨论3.1tmv弱毒株的获得植物病毒的变异机制有许多种,但自然突变率通常很低.一般而言,采用自然分离的方法也可以获得弱毒株,但并非对所有的病毒都适用.采用人工诱变处理,可大大提高突变频率,从而获得理想的弱毒株.人工诱变方法很多,可根据诱变剂的作用机理加以选择.在诱变育种中,经常应用复合处理的协同效应.在获得TMV弱毒株的方法上,前人大多采用单种诱变处理.Holmes通过热处理获得弱毒株TMV-M;日本大岛通过热处理TMV,在番茄上经4代繁殖得到L11A弱毒株,并已在日本大规模推广应用,保护番茄免受TMV强毒株的危害,获得增产15%-30%的保护效果;荷兰学者Rast用亚硝酸诱变TMV番茄株系获得MⅡ-16弱毒株;日本学者後藤中则ら采用热处理TMV辣椒株系,获得弱毒株Pa18;张秀华等用亚硝酸诱变获得2株TMV弱毒株(N11和N14);郑贵彬等采用亚硝酸诱变,获得TMV弱毒株(DN60-3).结果表明,采用热空气和亚硝酸的复合处理可显著提高有效突变频率,且优于单种诱变处理,因而可增加获得弱毒株的机率.要确定一个合适的诱变剂量,常常要经过多次试验.单独使用的适宜剂量对复合处理来说不一定是最适宜的剂量.如对提高突变频率来说,亚硝酸处理最适剂量的时间为40min或更长,但是复合处理最适剂量的时间为10min或更短.3.2tmv突变株的筛选及鉴定虽然使用诱变剂可提高突变频率,但是有效的突变频率还是相对较低的,因而通过诱变处理接种心叶烟后要尽可能多地进行单斑分离.采用一种灵敏度高、检测量大、快速、简便的检测方法即间接ELISA法,就能满足这些要求,但其出现假阳性的机率较高.出现阳性反应的应再用生物学方法(如接种单斑寄主)进行复检,出现阴性反应的也可用生物学方法确证.在本实验中,用间接ELISA法检测,TMV-152株为阴性,但2次接种强毒株后都不表现症状,最后用心叶烟检测,发现有枯斑产生,可能是刚开始检测时TMV-152株的浓度较低的原因.弱毒株的弱毒性能否稳定以及对其它植物是否产生危害是在应用弱毒株防治病毒病之前需要考察的内容.我们筛选到的弱毒株经4次毒力鉴定发现,有2株弱毒性稳定,且在可以系统侵染的植物上无症状,这为使用弱毒株提供了安全保障.但是弱毒株应用到田间后,弱毒性能否稳定,还有待于进一步观察.一般地,弱毒株的增殖速率比强毒株慢,浓度也较低,我们得到的弱毒株也是如此,这与发生突变的位点有关,可通过对TMV突变株的核苷酸序列测定,得到确认.而弱毒株的交互保护作用与弱毒株的增殖速率成正相关,因而在筛选弱毒株时也要把增殖速率作为一个指标.同时在接种弱毒株时,要采取相应的接种方法,必要时还可采用血清学方法检测,以确保接种成功.3.3接种间隔时间及苗期Mckinney发现植物病毒株系间存在着干扰现象,Kunkel提出利用弱毒株预防强毒株侵染的设想,Holmes通过热处理获得TMV弱毒株,并首次报道了利用弱毒株防治番茄花叶病的效果,之后,许多国家都进行了利用弱病毒防治植物病毒病害的研究.到目前为止,已有多种植物病毒的弱毒疫苗研制成功,并已开始小面积推广试验工作.关于弱毒株的交互保护作用机理在50年代就有过种种推测,也出现了一些假说,但直到目前还无定论.本实验考察的4个因素中,弱、强毒株接种间隔时间是影响弱毒株保护作用的重要因素之一.在接种间隔时间为1d(弱毒株增殖还处于潜伏期)、6d(弱毒株已增殖到一定程度,且已运输到系统叶)、17d(弱毒株在植株体内较充分扩展)时,不管烟苗处于哪个生长阶段以及强毒株的接种部位如何,以17d的保护作用为最好,其它组合效果不佳.这说明弱毒株在增殖到一定程度并在植株体内充分扩展后,保护作用才能达到较高水平,这与其他人的结论相符.苗期也是一个重要的因素,在旺长期,弱毒株的交互保护作用最好,这为弱毒株在田间的应用提供了理论依据,也为探讨弱毒株的保护作用机理提供了素材.弱毒株在植株体内能否保持稳定的浓度以及接种间隔时间如何影响保护作用,还有待于进一步研究.有多种因素影响弱毒株的保护作用,如作物品种,温度,强、弱毒株接种间隔时间及苗期等.本文尝试采用正交设计方法来考察这4个因素对弱毒株保护作用的影响,得出的结果与其他方法相似,说明这