不同剂量放射线照射时间对小鼠dpoae、abr的影响

不同剂量放射线照射时间对小鼠dpoae、abr的影响

癌症是中国南方最常见的肿瘤。放疗是治疗肿瘤的首选。放疗后，肿瘤年生存率为31%53%。但由于放疗的区域包括外耳、中耳及内耳,所以听力损失是鼻咽癌放疗后的一个常见并发症,对康复后患者的生存质量造成很大影响。鼻咽癌患者放疗时耳蜗接受的放疗剂量可达96%,因此放疗在杀伤肿瘤细胞的同时,势必损伤正常组织而产生副作用。感音神经性聋为放疗后常见并发症,放射性内耳损伤引起的感音神经性聋主要表现为渐进性听力下降,听力损失以高频为主,甚至会出现全聋。1962年就有学者发现头颈肿瘤患者接受放射治疗后出现感音神经性聋;Grau等也证明鼻咽癌患者放疗后出现的感音神经性聋大部分为高频听力损伤。目前放射后耳蜗的损伤已得到公认,但是由于放疗剂量、放射时间、放射源及观察对象不同,针对放疗后出现感音神经性聋的临界放疗剂量国内外还没有统一标准。对于放射后耳蜗以上的听力通路受到何种程度影响,国内外在这方面的研究相对较少。目前临床上耳蜗功能的监测多采用畸变产物耳声发射(DPOAE),耳蜗以上听觉通路的监测多采用听性脑干反应(ABR),二者的结合更有助于判断听觉神经通路的功能和完整性。本实验通过对小鼠进行DPOAE和ABR的监测,进一步探讨不同放射剂量及时间的放射线照射后小鼠耳蜗及其以上听觉神经通路损伤改变特点,为临床制定合理的放疗剂量及探讨放射性内耳损伤的机制提供更多实验依据。1小鼠外耳道麻醉后dpoa及abr反应1.1实验动物及分组。选用正常出生后4周龄Balb/c小鼠70只(耳),雄性,耳廓反射灵敏,排除外耳道及中耳感染,体重17~22g,由南方医科大学实验动物中心提供。随机分成4组,对照组(未接受照射)、实验1组(8Gy剂量照射)、实验2组(12Gy剂量照射),实验3组(16Gy剂量照射),对照组10只(耳),每个实验组20只(耳),每个实验组随机分成两组,各10只(耳),分别在照射后第3、7天进行各项指标的检测。1.2实验方法。1.2.1放射线照射早期感音神经性聋Balb/c小鼠模型的制备。小鼠称重,2%戊巴比妥钠溶液按0.3ml/l00g的剂量行腹腔注射麻醉后,俯卧位固定,在X线下定位,确定内耳照射区域。然后于相同体位固定在直线加速器治疗床上。采用美国Varian2100直线加速器6MeV电子线,剂量率为400cGy/min,源皮距100cm,用铅档块避免呼吸道、消化道受到照射。参考深度为皮下1.5cm,对照射组分别给予小鼠右耳单次8、12、16Gy的照射剂量。在放射线照射后分别于第3、7天对各项待测指标进行检测。1.2.2听力功能检测。在照射后第3、7天的时间点进行对照组和各实验组的DPOA及ABR检测。1.2.2.1DPOAE检测。2%戊巴比妥钠溶液按0.3ml/l00g的剂量行腹腔注射麻醉后,用水温40℃热水袋保温。将被检测小鼠置于隔声室中,使用GSIAuderaV2.7听觉诱发电位仪(美国GSI公司),用合适的探头塞入小鼠外耳道并使之密封,当刺激信号平稳后进行检测,两个初始强度音均为80dBSPL,两者频率之比为f1/f2=1.22。由于小鼠3kHz以下的DPOAE反应较差,故选择记录和分析频率范围为3~12kHz,即4、6、8、10、12kHz5个频率,读取2f1-f2处的幅值反应强度。反应幅值以高于本底噪音3dB为有反应的记录标准。1.2.2.2ABR检测。2%戊巴比妥钠溶液按0.3ml/l00g的剂量行腹腔注射麻醉后,用水温40℃热水袋保温。将针形电极的记录电极置于颅顶正中皮下,参考电极置于同侧乳突,接地电极置于鼻尖部。刺激声为疏密相交替的12.1次/s的短声(click),持续时间为0.1ms,带通滤波300~3000Hz,观察时程20ms,叠加次数800次。在距外耳道口1.5cm处通过插入式耳机给声,从90dBSPL开始,首先以10dB递减刺激声,然后5dB递减,以能分辨出ABR波型中I波的最低刺激强度确定ABR阈值,并记录刺激强度60dBSPL时I、II潜伏期。1.3统计学处理。实验结果均采用SPSS13.0统计软件进行方差分析,取P<0.05为差异有统计学意义。2正常组和照射组dpooa幅值比较2.1DPOAE检测结果。小鼠分别接受8、12、16Gy放射剂量后第3天的DPOAE幅值与对照组比较无明显改变(P>0.05)。照射后第7天在8、10、12kHz时,不同放射剂量组小鼠DPOAE幅值均较正常对照组小鼠显著减小,有统计学意义(P<0.05);正常对照组、照射各组小鼠DPOAE幅值随照射剂量的增加依次逐渐降低(表1,表2,图1~图3)。2.2ABR检测结果。分别给予小鼠8、12、16Gy放射剂量后,照射后第3天反应阈出现短暂提高,照射后第7天反应阈恢复正常,呈波动性改变。照射第3天反应阈的改变与正常对照组比较有统计学意义。I、II潜伏期在照射后第3天较正常对照组时间显著延长,有统计学差异(P<0.05),在照射后第7天潜伏期恢复正常,与正常对照组比较无明显改变,差异无统计学意义(P>0.05,表3~表5,图4~图6)。3放疗后听力损伤的变化头颈肿瘤患者放疗后听力损伤的发生率约为20%,主要为感音神经性聋。Schultz等通过对141例头颈肿瘤患者的前瞻性研究发现,听力损伤主要为感音神经性聋或混合性聋,而且放疗后出现的感音神经性聋以高频段为主[5～9];也有学者很早就提出鼻咽癌患者放疗后出现感音神经性聋的程度与放疗时间密切相关。然而放疗后何时会出现感音神经性聋并发症,国内外的研究并没有得出统一结论。有学者[11，12]证明在放疗后前几个月并未出现听力损伤。陈平等通过对14例鼻咽癌患者放疗后出现突发性感音神经性聋进行临床观察与分析后发现,出现突发性感音神经性聋的时间平均为6.6年,患者在出现突发性感音神经性聋前均有不同程度的听力损失,而且这种听力变化反复发作。本实验研究中小鼠分别在接受8、12、6Gy放射剂量后的第3天DPOAE幅值与对照组比较无明显改变(P>0.05);照射后第7天时,不同放射剂量组小鼠8、10和12kHz的DPOAE幅值均较正常对照组小鼠降低,有统计学意义(P<0.05);正常对照组、实验组小鼠DPOAE幅值依次逐渐减少。以上实验研究的结果表明在放射后第7天出现听力改变。有关放射线照射后的听力损伤与放射后的时间关系,Ho等针对294例接受放疗治疗的鼻咽癌患者进行前瞻性研究,发现31%的患者在放疗后3个月在4kHz出现听力下降,14%的患者在0.5、1、2kHz频段出现听力下降,其中有40%的患者在放疗后两年时听力有所恢复,但随访4.5年后发现放疗引起的听力损伤随着时间的延长呈进行性加重。总之,放疗后早期患者便可出现听力下降,早期听力损伤变化可为可逆性的,但是后期的损伤随着时间延长而逐步加重。同样郭运凯等对28例放疗后出现感音神经性聋的鼻咽癌患者进行临床跟踪观察,分别在放疗前、放疗后1个月,1、2、5年进行纯音测听和ABR测试,发现放疗后早期即出现听力下降,并且随着时间延长听力损失逐渐加重。Wang等也通过研究发现放疗后这种早期听力变化只是暂时的,但是这种听力变化是呈慢性或渐进性的发展过程。放疗后感音神经性聋的发生除了与时间相关外,还与放射剂量具有相关性。Zuur等对接受放疗的头颈肿瘤患者进行跟踪观察来探讨放疗引起听力损伤的危险因素,发现放疗剂量与放疗后引起的听力损害具有相关性。本实验研究中给予小鼠8、12、16Gy放疗剂量后,在第7天行DPOAE测试后经统计学分析发现,随着放疗剂量的增加高频段的DPOAE幅值逐渐减低。这种DPOAE幅值下降可能与放疗剂量具有相关性的结果与Zuur等研究一致,并证明了听力损伤以高频段为主的观点。综合国内外研究以及本研究结果发现,在放射早期可以出现耳蜗损伤,早期听力损伤可能是短暂的和可逆的,但随着时间延长和放疗剂量的增加听力损伤逐渐加重。然而这些结论仍需要进行大样本的调查与研究来确定耳蜗放射性损伤出现的时间以及耳蜗损伤的临界放疗剂量,以便能为及早采取防治措施提供客观依据。本研究通过ABR测试就放射线照射后耳蜗及其耳蜗以上的听觉神经通路和功能的改变进行观察。小鼠ABR特征主波为I、II波,反应阈的测定是以I波或者II波的消失为判断标准,平均反应阈值为(33.00±8.56)dB[17，18]。观察本实验研究的ABR检测结果发现60dBSPL强度刺激下I波普遍存在,某些小鼠的检测结果中II波缺失,I波相对比较稳定,所以本实验研究以I波的消失来确定小鼠反应阈。根据测试结果的统计学分析发现,在分别给予小鼠8、12、16Gy放射剂量后,第3天反应阈出现短暂提高,第7天反应阈恢复正常,呈波动性改变。照射后第3天反应阈的改变与正常对照组比较有统计学意义(P<0.05)。I、II潜伏期在照射后第3天较正常对照组明显延长(P<0.05),照射后第7天潜伏期恢复正常,与对照组比较无明显改变(P>0.05)。这些结果表明小鼠耳蜗以上的听觉通路在放射早期只是出现短暂的功能改变,至于随着时间的延长会出现何种改变有待进一步研究。对于放疗后引起的听觉中枢损伤的研究目前不多,Low等对27例鼻咽癌放疗患者进行前瞻性研究,分别于放疗前及放疗3个月、1.5年、4年后对患者进行ABR测试,发现放疗前与放疗后I与III、I与V、III与V的波间潜伏期未见明显差异,同时I~V波的潜伏期在放疗前后也没有明显差异,结果表明患者在放疗后较长时期内耳蜗以上听觉神经通路是相对完整的。然而也有学者通过对腮腺肿瘤患者的跟踪观察发现,患者在放疗后2年不但内耳出现损伤,而且听神经及脑干听中枢均受到不同程度的损伤。根据本研究的结果结合文献资料可以认为,耳蜗以上听觉通路功能的波动性改变可能只是暂时的,但仍需更长的研究时间来加以证实。关于放射治疗后耳蜗以上的听觉神经通路何时出现改变以及可以耐受的放疗剂量也有待于进一步的实验研究。目前针对放疗后所致感音神经性聋的机制尚不明确,认为辐射对组织细胞的损伤机制可能是脂质过氧化作用产生的一系列自由基反