连钱草提取物抗炎作用机制研究

连钱草提取物抗炎作用机制研究

连草是嘴唇科植物的活血丹glecodapr（nakai）kuber。具有利湿通淋、清热解毒、散淤消肿的功能。在民间被广泛应用于治疗尿路感染、感冒、跌打损伤、风湿性关节炎、腹泻等。笔者在本实验中对连钱草的抗炎作用作了初步研究,重点从炎症递质方面对其进行药理实验。现将结果报道如下。1药物、试剂和实验动物1.1材料连钱草(自行采集于武汉大学珞珈山,经湖北中医学院中药鉴定教研室陈家春教授鉴定)。连钱草水提物的制备:取适量连钱草干品,加纯化水浸泡30min后,加热煮沸,开始用强火,沸腾后改用文火煮沸30min,搅拌,趁热过滤,药渣再加纯化水同法煮沸30min后过滤,合并滤液,水浴浓缩至100%(含生药1g·mL-1)备用。连钱草醇提物的制备:取连钱草干品适量,加95%乙醇于圆底烧瓶中,浸泡6h后水浴加热回流1h,趁热过滤,药渣再用75%乙醇加热回流1h,过滤,合并滤液,减压回收乙醇浓缩至100%(含生药1g·mL-1)备用。阿司匹林(湖北制药厂生产,临用前用1%CMC-Na配成混悬液备用);蛋清(市场上购买的新鲜鸡蛋,取其蛋清);伊文思蓝(上海化学试剂采购供应站经销,行知校办厂分装);角叉菜胶(购自Sigma公司);二甲苯、乙酸、乙醇、甲醇、正丁醇、正庚烷、邻苯二甲醛(OPT)、NaIO4、氯化钠等试剂均为国产分析纯或进口分装。1.3实验动物昆明种雌性未孕小鼠,体重18~22g;昆明种雄性小鼠,体重18~22g。所有动物均由湖北省医学实验动物中心提供。1.4仪器Bs200s电子天平(Sartorins公司),723紫外分光光度计(上海精密科学仪器有限公司),LuminnescencespectrometerLS55荧光仪(PerkinElmerinstruments),TL04A离心机(北京大恒建海科贸公司)。2方法和结果2.1醇提物对小鼠耳水肿的影响取雄性小鼠32只,体重18~22g。按体重随机分为4组各8只,即0.9%氯化钠溶液组、阿司匹林组、连钱草醇提物组和连钱草水提物组。每天灌胃给药1次,连续3d,末次给药后45min,以二甲苯0.02mL均匀涂于小鼠左耳廓两侧致炎,致炎1h后处死小鼠,沿耳廓基线剪下左右两耳片分别称重,以两耳重量差作为肿胀度。结果见表1。连钱草水提物与醇提物对二甲苯致小鼠耳肿胀有显著的抑制效果。与0.9%氯化钠溶液组比较,*1P<0.052.2小鼠造林后的毛细管透气性取雄性小鼠24只,体重18~22g。按体重随机分为4组各6只,即0.9%氯化钠溶液组、阿司匹林组、连钱草醇提物组和连钱草水提物组。每天灌胃给药1次,连续3d,末次给药1h后各鼠尾静脉注射0.5%伊文思蓝0.1mL·(10g)-1,随后腹腔注射0.6%醋酸,每只0.2mL。20min后处死小鼠,各鼠用5mL0.9%氯化钠溶液分次冲洗腹腔,收集腹腔洗出液,用722型分光光度计在590nm波长处测定吸光度值。结果见表2。连钱草水提物与醇提物对醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性增加有显著的抑制效果。与0.9%氯化钠溶液组比较,*1P<0.052.3角叉菜胶对小鼠水肿足中pge2含量的影响取雄性小鼠40只,体重18~22g。按体重随机分为4组,即0.9%氯化钠溶液组、阿司匹林组、连钱草醇提物组和连钱草水提物组。各组小鼠每天灌胃给药1次,连续3d,末次给药后45min,每只小鼠右后足垫皮下注射角叉菜胶0.9%氯化钠溶液0.1mL,40min后从小鼠齐踝关节处剪下左后足,分别称重,划破皮肤后浸于装有2.5mL0.9%氯化钠溶液的试管中,不时振摇,2h后取出,将浸泡液3000r·min-1离心15min,取上清液0.3mL置于试管内,加入0.5mol·L-1氢氧化钾(KOH)甲醇溶液1.0mL,50℃水浴20min异构化,加甲醇2.5mL,在278nm波长下进行比色,测定吸光度(A)值,用A值表示PGE2含量。结果见表3。连钱草醇提取物对角叉菜胶致小鼠肿胀足组织中炎症递质PGE2的释放没有抑制作用,而水提物组PGE2含量明显升高。与0.9%氯化钠溶液组比较,*1P<0.012.4醇提物对炎性足中组织胺含量的影响取雄性小鼠27只,体重18~22g。按体重随机分为3组,即0.9%氯化钠溶液组、连钱草醇提物组和连钱草水提物组。均每天灌胃给药1次,连续3d,末次给药后45min,每只小鼠右后足垫皮下注射10%新鲜蛋清0.9%氯化钠溶液0.1mL,同时0.9%氯化钠溶液[灌胃,4mL·(100g)-1]行水负荷。致炎后40min沿踝关节处剪下致炎足,称重,划破皮肤组织后浸泡于酸化正丁醇0.2mL中2.5h,再用超声处理20min,去掉致炎足,浸液离心。取上清液1.5mL,加入正庚烷3mL和0.1mol·L-1盐酸1.2mL,振摇5min,离心(3000r·min-1,5min),离心后取水相5mL,加入3mL三蒸水稀释,再加0.4mol·L-1NaOH碱化,混匀,并迅速加入0.1%OPT溶液0.1mL,立即混匀,并在21~22℃反应10min,然后加入0.5mol·L-1盐酸1mL酸化以终止缩合反应,在激发光波长360nm,发射光波长440nm下测定荧光强度,用荧光强度(int)表示炎性足组织中组织胺的相对含量(荧光法),比较给药组和空白对照组组胺相对含量的差异。结果见表4。连钱草水提物对蛋清致小鼠肿胀足组织中炎症递质组胺的释放有明显抑制作用,但醇提物组织胺含量明显升高。与0.9%氯化钠溶液组比较,*1P<0.052.5连钱草水提物int-取雄性小鼠27只,体重18~22g。按体重随机分为3组,即0.9%氯化钠溶液组、连钱草醇提物组和连钱草水提物组各9只。每天灌胃给药1次,连续3d,末次给药后45min,每只小鼠右后足垫皮下注射10%新鲜蛋清0.9%氯化钠溶液0.1mL,同时0.9%氯化钠溶液[灌胃,4mL·(100g)-1]行水负荷。致炎后40min沿踝关节处剪下致炎足,称重,划破皮肤组织后浸泡于酸化正丁醇0.2mL中2.5h,再用超声处理20min,去掉致炎足,浸液离心。取上清液1.5mL,加入正庚烷3mL和0.1mol·L-1盐酸1.2mL,振摇5min,离心(3000r·min-1,5min),离心后取水相5mL,加入0.2mL5%半胱氨酸,再加0.004%的OPT盐酸溶液6mL,混匀,并加入0.20mL0.02%的NaIO4溶液,沸水浴10min,在激发光波长365nm,发射光波长480nm下测定荧光强度,用荧光强度(int)表示炎性足组织中5-羟色胺的相对含量(荧光法),比较给药组和空白对照组5-羟色胺相对含量的差异.结果见表5。连钱草水提物对蛋清致小鼠肿胀足组织中炎症递质5-羟色胺的释放有明显抑制作用(P<0.05),醇提物组有抑制5-羟色胺释放的作用,但作用较水提物小。与0.9%氯化钠溶液组比较,*1P<0.053炎症递质pge2、组织胺和5-羟色胺含量的测定炎症是机体活组织对各种损伤因子所发生的以防御为主的反应,连钱草提取物对二甲苯致小鼠耳廓肿胀和小鼠腹腔毛细血管通透性增加等炎症模型具有较强的抑制作用,表明连钱草提取物具有较强的抗炎作用。而PGE2、组织胺和5-羟色胺均为参与炎症反应的主要炎症递质,在炎症反应中起重要作用。笔者使用