响应面法优化连钱草总黄酮提取工艺

响应面法优化连钱草总黄酮提取工艺

连草是属于嘴唇科的血毒症[glechomalanituba（nakai）kubar.]干燥的土壤部分。连钱草性味凉辛,微苦,微寒。归肝、肾、膀胱经,具有利胆、利尿、抗菌、抗炎、降血糖、抗肿瘤以及抗腹泻等药理作用,主治黄疸型肝炎、胆囊炎、胆石症、疳积、肾结石、膀胱结石、多发性脓疡、疮痈肿痛、婴儿湿疹、跌打损伤、腮腺炎、牙痛等症。连钱草的主要化学成分有萜类、黄酮、挥发油、有机酸以及多糖等。其中,萜类化合物主要包括熊果酸、齐墩果酸、乌苏酸、2-羟基乌苏酸等;黄酮和黄酮苷类化合物包括木犀草素、芦丁、芹菜素、刺槐素、海常素、胡萝卜苷、槲皮素、连钱草酮等;挥发油类化合物包括左旋薄荷酮、胡薄荷酮、旅烯、柠檬烯、1,8-桉叶素、异薄荷酮、异松樟酮、α-松油醇等,具有特殊的清香味;有机酸类化合物包括阿魏酸、咖啡酸、介子酸、月桂酸、迷迭香酸、原儿茶醛、迷迭香酸甲酯、三十烷酸、肉豆蔻酸等有机酸。目前针对连钱草总黄酮提取工艺的研究尚不多见。本研究通过考察提取时间、提取温度、液固比和乙醇等因素,采用单因素试验和Box-Behnken试验优化了连钱草总黄酮的提取工艺,结果理想,报告如下。1仪器和试剂盒1.1主要仪器和设备TU-1810型紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)、RT-02A型多功能粉碎机(弘荃机械企业有限公司)、BECKMANCOUCTER型离心机(美国BECKMAN公司)、HHS型恒温水浴锅等仪器(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)。1.2植物活检丹glechomalus连钱草由南京同仁堂洪泽中药材科技有限公司提供(经姜宁副教授鉴定为唇形科活血丹属植物活血丹[Glechomalongituba(Nakai)Kupr.]),烘干,粉碎,过60目筛;无水乙醇、芦丁、亚硝酸钠、硝酸铝等均为分析纯,购自国药集团化学试剂有限公司。2方法和结果2.1黄酮含量测定2.2bohsk试验2.2.1c.11d回归模型在预试验基础上,采用Design-Expert8.0的Box-Behnken设计,以提取时间、温度、液固比、乙醇浓度为自变量,黄酮提取率为响应值。试验因素水平设计和结果分别见表1、表2。根据试验结果,建立了如下回归模型:R=6.38–0.16A+0.057B+0.44C+0.11D+0.15AB+0.11AC+0.62AD+0.36BC+0.030BD+0.013CD-0.63A2–0.61B2–0.85C2–0.54D2。该回归模型的决定系数R2为0.9746,校正后的决定系数(adj-R2)为0.9493,说明该模型拟合性较好。对回归模型和各因子进行方差分析,结果见表3。从表3可知:该模型F值为38.41,P值<0.0001,而失拟性试验F值为2.19,不显著,说明此模型与实际情况拟合得较好。根据F值和P值,可以得出各因素对响应值的作用由大到小为:C2>A2>B2>C>D2>AD>BC>A>D>AB>AC>B>BD>CD。其中:B、AB、AC、BD、CD对响应值的作用不显著,所以上述回归方程中以上几项可以忽略,所得回归方程如下:R=6.38–0.16A+0.44C+0.11D+0.62AD+0.36BC-0.63A2–0.61B2–0.85C2–0.54D2。2.2.2黄酮提取率的确定由Box-Behnken试验结果所得的回归方程,可以计算出当A=-0.05,B=0.13,C=0.28,D=0.08时,R有极大值6.45%。将各因素的水平回代,可以得到最优工艺是提取时间1.4975h,41.3℃,液固比22.8∶1,乙醇浓度90.4%时,黄酮提取率最高。为了操作方便,将优化的工艺确定为提取时间1.5h,提取温度41℃,液固比23∶1,乙醇浓度90%,并对该工艺进行了验证,连钱草黄酮提取率在6.32%~6.47%之间。说明经过响应面法优化的工艺具有很强的实践指导作用。2.2.3不同a和c和d对黄酮提取率的影响图1为响应面分析。从中可以看出:当C=0.28,D=0.08时,黄酮的提取率随着A和B的增加而上升,当达到最大值后,A和B的上升反而会使提取率下降(图1A);B和D分别为0.13、0.08时,A和C处于低水平时,响应值较低,随着A和C的升高,响应值也随之升高,当到一定程度后,响应值不再随A和C的上升而上升,而是下降(图1B);如B=0.13、C=0.28,A和D的变化会显著影响黄酮的提取率,当A和D较小时,黄酮提取率也较低,当A和D增大后,提取率也增高,当提取率达到极大值后,其会随着A和D的上升而下降(图1C);图1D显示了B和C对响应值的影响,响应值开始随着B和C的上升而上升,当达到一定值后,反而会随着B和C的上升而下降;随着B和D的变化,响应值的变化则较平缓(图1E);A=-0.05、B=0.13时,当C和D较小时,提取率也较低,C和D上升后,提取率也增加,当提取率达到最大值后,C和D的增加反而会使提取率下降,不过下降的幅度较上升的幅度平缓(图1F)。3提取过程中黄酮与植物的相互作用提取时间、提取温度、液固比和乙醇浓度是影响黄酮提取率的四个主要因素。提取时间的延长会增加植物体内的黄酮溶出,当提取达到一定时间后,连钱草黄酮的提取率不再显著增加,这是因为浸出液中黄酮与植物内的黄酮浓度差缩小,黄酮溶出速度下降。提取温度41℃时连钱草黄酮的提取率最高,随后温度的提高反而会使提取率下降,说明高温可能会破坏连钱草黄酮的结构。液固比的增加会提高植物内黄酮与浸出液中黄酮的浓度差,从而加快黄酮的溶出,但当液固比过大时,会使后续处理繁琐,加大处理过程中的损耗从而