2真核基因转录及加工

真核生物基因转录RogerD.Kornbergwasawardedthe2006NobelPrizeinChemistry"forhisstudiesofthemolecularbasisofeukaryotictranscription".真核生物基因转录应用真核生物基因转录特点：1.转录启动子结构复杂，不同类型的RNA有不同的启动序列；2.多种RNA聚合酶转录不同的RNA产物；3.多个调节因子参与转录调节；4.转录和翻译在时间和空间上分隔，转录后存在广泛的加工。

1.RNA聚合酶启动子、调节序列和调节蛋白通过DNA-蛋白质相互作用、蛋白质-蛋白质相互作用影响RNA聚合酶活性。RNAPolI:rRNA,相对活性50-70%RNAPolII:mRNA,相对活性20-40%miR-RNAPolIII:tRNA,相对活性10%RNAPolIV:smallncRNA,相对活性??真核生物三种RNA聚合酶的比较真核生物的特异DNA序列真核生物基因组中含有可以调控自身基因表达活性的特异DNA序列，称为顺式作用元件(cis-actingelement)。

顺式作用元件能够被转录调节蛋白特异识别和结合，从而影响基因表达活性。启动子(promoter)

顺式作用元件又分增强子(enhancer)沉默子(silencer)En/SiProDNA编码序列转录起始点Sequenceelementswithinatypicaleukaryoticgene1GCTATACAATGC-25-50-80-95-1301

basedonthethymidinekinasegeneoctamertranscriptionelementpromoterTATAbox(TATAAAA)

locatedapproximately25-30bpupstreamofthe+1startsite

determinestheexactstartsite(notinallpromoters)bindstheTATAbindingprotein(TBP)whichisasubunitofTFIIDGCbox(CCGCCC)

bindsSp1(Specificityfactor1)CAATbox(GGCCAATCT)

bindsCTF(CAATboxtranscriptionfactor)Octamer(ATTTGCAT)

bindsOTF(Octamertranscriptionfactor)+1ATTTGCATTSS核心元件区上游调控区基因调控区：由三部分组成核心元件区：——决定是否转录由TATAbox和起始位点（TSS）组成上游调控区UPE(UpstreamPromoterElement)

：具多种调控元件CAAT框、GC框等，含其中一种或多种，决定转录强弱（转录活化和转录起始频率），启动子的强弱取决于UPE的类型。确定真正的起始位点远端调控区：位于转录起始位点更上游；如β–珠蛋白基因的远端调控区在-1300—-3300间增强子：使与它连锁的基因转录频率明显增强的DNA序列，作为基因表达的重要调节元件。特点：1.增强效应明显（10–200倍）；2.增强效应与其位置和取向无关；3.大多为重复序列，一般50bp；

4.增强效应有严密的组织和细胞特异性，只有特定的蛋白质（转录因子）参与才能发挥其功能；5.没有基因专一性。作用机制：通过改变模板DNA的整体结构（影响DNA-Pro复合物的结构或改变DNA超螺旋密度）eg.形成Z-DNA，增强子才有功能。一个增强子并不限于促进某一特殊启动子的转录，它能刺激附近的任一启动子。GenecloneHACNS1增强子HACNS1（又叫CENTG2）是对进化有贡献的一个基因增强子。如今有证据显示在人类基因组发现的十一万基因增强子中HACNS1在人类与祖先黑猩猩分道扬镳之后的进化过程中变化最大，对人手指和可能改造脚踝以适应人类两腿行走意义。5SrRNA基因内启动子在转录区内启动子有三种类型：基因内启动子基因外启动子混合启动子14Typicalstructureofaneukaryoticgeneenhancerorsilencer5’UTR3’UTR

2.真核基因的调节蛋白

反式作用因子(trans-actingfactor)

能直接或间接与顺式作用元件相互作用，进而调控基因转录的一类调节蛋白，统称为反式作用因子。按其功能不同，常有以下三类：

基本转录因子:识别promoter元件转录调节因子:识别enhancer或silencer共调节因子：不能进行DNA-蛋白质相互作用RNA聚合酶Ⅱ在转录因子帮助下，形成的转录起始复合物polⅡTFⅡHTAFTFⅡFTAFTAFTFⅡATFⅡBTBPTATADNATAF:TBPassociatedfactorsholoenzyme（1）基本转录因子(generaltranscriptionfactor)

是指能够直接或间接与启动子核心序列TATA盒特异结合、并启动转录的一类调节蛋白。TBP:TATA-boxbindingproteinTFII:polIIassociatedTF(2)转录调节因子(transcriptionfactor,TF)

这类调节蛋白能识别并结合转录起始点的上游序列和远端的增强子元件，通过DNA－蛋白质相互作用而调节转录活性。决定不同基因的时间、空间特异性表达. 转录激活因子(transcriptionalactivator) 转录阻遏因子(transcriptionalrepressor)（3）共调节因子(transcriptionalregulator/co-factor)首先与转录因子发生蛋白－蛋白相互作用，进而影响它们的分子构象，以调节转录活性,本身无DNA结合活性。如果与转录激活因子有协同作用——共激活因子；与转录阻遏因子有协同作用——共阻遏因子。常见转录因子的结构域(domain)DNA结合域（DNAbindingdomain)锌指BasicAA(K/R)rich,positivelycharged转录激活域(trans-activationdomain)TF蛋白质-蛋白质结合域（dimerization,co-factors）谷氨酰胺(Q)富含域酸性激活域(D/E-rich)脯氨酸(P)富含域碱性亮氨酸拉链最常见的DNAbindingdomain锌指(zincfinger)C——CysH——His常结合GCbox典型的类固醇激素受体(steroidhormonereceptor)结构示意图(2ZincfingersintheDBdomain)

碱性亮氨酸拉链（bZIP:basicLeuZip)结构域转录激活因子序列比较

碱性亮氨酸拉链转录激活蛋白与调控区DNA相结合的示意图

bHLH蛋白(basicHelix-Loop-Helix)同源域(Homeodomain)蛋白通过其第三个螺旋与双链DNA的大沟相结合，其N端的延伸部分则与DNA的小沟相结合，提高了稳定性

常见的转录活化结构域

真核基因表达调控真核基因转录调节是复杂的、多样的网络*不同的DNA元件组合可产生多种类型的转录调节方式。*多种转录因子又可结合相同或不同的DNA元件。*转录因子与DNA元件结合后，对转录激活过程所产生的效果各异，有正性调节或负性调节之分。真核基因表达的多级调控组蛋白修饰DNA甲基化转录调控转录后加工mRNA降解蛋白质降解蛋白质翻译翻译后修饰1.染色质水平调节主要依赖于辅助调节因子对染色质结构进行修饰。辅助调节子通过三种方式对染色质结构起调节作用：1）依赖于ATP的核小体重建复合体（ADRC）：它们依靠水解ATP所产生的能量来改变核小体的相对位置，将DNA序列暴露出来，使转录因子能够与之结合。这是一个物理过程，染色质本身的结构并没有变化，只改变核小体的相对位置。2）组蛋白修饰：主要通过共价修饰组蛋白的末端来改变染色质结构。当构成染色质的组蛋白发生修饰时，就会影响染色质的构型，而结构的变化引起基因转录活性的变化。3）DNA甲基化：真核DNA约有5%的胞嘧啶被甲基化。一般而言，DNA甲基化抑制基因表达。

组蛋白发生修饰，碱基暴露等原因而引起核小体结构改变，使核小体不稳定性增加。Sequence-independentlinkerhistones:controlDNAcompactionandaccessibilitytotrans-actingfactorspost-translationalmodificationsofhistonetails:controlcompactionofDNAandserveasdockingsitesfortrans-actingfactorsDNA甲基化对基因转录的抑制作用

甲基化预测在我们的基因组中，发生甲基化的DNA影响基因的开关。基因表达能够推断与我们的身份相关联的几种属性，如性别、种族、年龄和健康，甚至童年时代经历。FactorsunderlyingvariableDNAmethylationinahumancommunitycohort.LuciaL.Lama,etal.doi:10.1073/pnas.11212491092.DNA水平的调节

真核基因一般都处于阻遏状态，RNA聚合酶对启动子的亲和力很低。通过利用各种转录因子正性激活RNA聚合酶是真核基因调控的主要机制。3.RNA水平的调节转录后加工：真核基因大多为断裂基因，内含子和外显子一起被转录。转录后产物经剪接（包括可变剪切,alternativesplicing）、加帽、加尾等加工修饰，才能转变为成熟的mRNA。RNA降解：包括非特异性降解（RNase,exosome)和特异性降解(NMD，RNAi)。4.蛋白水平的调节蛋白质合成:ribosome蛋白翻译，构像折叠，细胞内定位蛋白质修饰:包括磷酸化(phosphorylation),乙酰化(acetylation)，甲基化(methylation),糖基化(glycosylation),etc蛋白降解：包括非特异性降解（protease,peroxisome，vacuole)和特异性降解(Ubiquitin/proteasomesystem,下下次课具体讲)。真核基因表达调控的主要步骤

染色质去组装蛋白质修饰生化功能真核基因转录后的加工

1.真核基因转录产物的特点：含内含子，需经剪接去除；需要修饰（加帽、加尾，稀有碱基）；转录和翻译是两个相对独立的过程。

2.加工类型:加帽、加尾修饰——甲基化、酰基化剪接RNA编辑RNA加工的意义：活化——使无活性的前体RNA加工成有活性的成熟RNA；（rRNA、tRNA的剪接、修饰）改变基因的编码产物——同一转录产物，不同剪接方式，编辑方式，蛋白产物不同；调节方式——加工会影响RNA的活性、半衰期、运输等，影响RNA功能的发挥；编码蛋白质的结构基因在核浆中被转录，RNA分子很大，且很不稳定，由于大小很不一致，称为核内不均一RNA（hnRNA），其中mRNA是由hnRNA加工成的。hnRNA25%——mRNA75%——在核内降解hnRNA先加帽，hnRNA尾端被切去一段后，加poly（A）尾，切除内含子成为mRNA，进入细胞浆内。加帽(Cap0、CapI、CapII三种帽子结构)在细胞核中进行，hnRNA的5’端常为GTP，帽子化过程后，形成m7G5’ppp5’Np结构。5’帽子的功能：保护mRNA免受5’-核酸外切酶降解；使mRNA进入细胞质；对翻译起识别作用（m7G5’ppp5’Np优先与核糖体结合）。三种帽结构初级转录物的切除与多聚腺苷酸化RNAsplicingandediting剪接splicing——把断裂基因转录本中的内含子除去

真核生物基因是断裂基因(splitgene)

外显子(exon)与内含子(intron)Alternativepromoters&RNAsplicing-essentiallydisprovedtheoldernotionthatasinglegenesequenceencodedasingleprotein图8-9可变剪接导致α-淀粉酶基因在不同组织中的表达差异

内含子的剪接方式自我剪接（由RNA分子本身完成）：Ⅰ型Ⅱ型剪接体SnRNP参与——mRNA酶蛋白参与的剪接——tRNASnRNA参与的mRNA前体的剪接自我剪接与剪接体催化的剪接比较InhibitionofRNAHelicaseBrr2bytheC-TerminalTailoftheSpliceosomalProteinPrp8.Science,May232013;DOI:10.1126/science.1237515mRNA的不同剪接产物在某些生物中，在不同分化时期，RNA种类无区别，基因表达差异靠加工实现，如海胆卵母细胞。不同剪接方式：产物中少一个外显子；产物中外显子不同；内含子保留；5’剪接点改变；3’剪接点改变。剪接错误造成贫血病RNA编辑(RNAediting)

DNA上不存在，在RNA产物中插入或删除几个碱基的现象。类型：U的插入和删除；G/C/A的插入（改变其阅读框）；C—U互变改变密码子，构建终止密码。

——是基因表达的一种转录后调控机制RNA的编辑(RNAediting)

大多数mRNA中缺少适当的、完整的起始密码，不能正确起始翻译，经编辑后可生成成熟mRNAmRNA甲基化m6A新发现，20%的人类mRNA中N6-甲基A腺苷(m6A），存在5000多个不同的mRNA分子中。包括许多人类疾病基因编码的mRNA中，包括癌症以及一些大脑疾病，如孤独症、阿尔茨海默病、精神分裂症。RNA甲基化是一种可逆修饰，参与大量生物学通路和生理过程。mRNA甲基化缺陷引起疾病。肥胖症风险基因FTO突变的人m6A水平低下，食物摄入和代谢异常，从而导致肥胖。据估计，全球10亿人有FTO突变，此突变是肥胖症及2型糖尿病的主要病因ComprehensiveAnalysisofmRNAMethylationRevealsEnrichmentin3′UTRsandnearStopCodons.KateD.Meyer,etal.doi:10.1016/j.cell.2012.05.003DavidBaulcombeForthediscoveryofRNAinterference–genesilencingbydsRNAandsmallRNAfunctionalRNAtranscripts(tRNA,rRNA,miRNA)

MicroRNAs(miRNAs)canregulategeneexpressionRNAiNatureReviewsMolecularCellBiology8:23–36(2007)siRNAmiRNARNAactsasaregulatorofgeneexpression----genesilencingmicroRNA大多数的microRNA是通过Drosha将长链的原始转录本剪切成约含有颈环结构的65个碱基的microRNA前体，再由Dicer将其加工为含有约22个碱基的双链成熟microRNA。成熟的microRNA与Argonaute蛋白复合体结合，通过不完全配对靶向mRNA，阻遏翻译。mse-tsRNAs成熟精子中大量存在一类来源于tRNA的小分子RNA。这类小RNA的长度主要富集于29-34nt，类似但不同于睾丸中的piRNA；命名为mse-tsRNAs(mature-sperm-enrichedtRNAderivedsmallRNAs)。mse-tsRNAs的含量占小鼠精子小RNA测序reads总量的67.54%；mse-tsRNAs在成熟精子头部富集，说明其能够在受精时进入卵细胞,可能作为一种古老的父源信息在受精时传递给卵细胞。AnovelclassoftRNA-derivedsmallRNAsextremelyenrichedinmaturemousesperm.HongyingPeng,etal.,cellresearch,2012/10/09RNA到RNA的复制人类细胞中的所有RNA都从DNA模版复制.从RNA到RNA的复制机制，只存在于植物和酵母菌中，与一种名为RNA依赖性RNA聚合酶（简称RdRP）有关，这种酶参与关键性细胞调控程序。研究发现，人类细胞中有数千种能直接复制的sRNA。Newclassofgene-termini-associatedhumanRNAssuggestsanovelRNAcopyingmechanism.Philippetal.Naturedoi:10.1038/nature09190Contemporaryconceptofgeneexpressionregulation

InformationencodedinDNAismorecomplexthanpreviouslyrealized:•Alternativepromoters•RNAsplicing•Non-codingrepetitiveDNA•SeparategeneproductswithoverlappingDNAsequences•Antisensegenetranscripts•Multiplegeneproductscombinetoformasingleprotein•Trans-actinggeneenhancerslocatedondifferentchromosomes•GenesalsoencodefunctionalRNAs(non-proteincoding)•RNAbasedinheritancemechanismsAlternativepromoters&RNAsplicing-essentiallydisprovedt