葡萄酒产地技术的追溯

葡萄酒产地技术的追溯

随着中国经济的快速发展，中国居民的消费能力日益增强。葡萄酒作为一种有益的酒精饮料,越来越受到国内消费者的青睐。根据海关总署数据统计,2011年,我国葡萄酒进口量为3.25亿L,同比增长30.9%,进口金额达12.65亿美元。虽然我国人均葡萄酒消费只有世界平均水平的6%,但在全球葡萄酒行业发展增速趋缓的背景下,我国进口葡萄酒数量仍出现了迅速上升的趋势,说明国内葡萄酒市场发展潜力十分巨大。葡萄酒的产地在很大程度上决定了其价值,葡萄酒消费者习惯于根据葡萄酒标签来判定葡萄酒是否值得购买,却鲜有能通过葡萄酒内在品质来选择,因此一些不法葡萄酒厂商通过仿造酒标、旧瓶装新酒等手段冒充高价值产区的葡萄酒来获取暴利。欧洲是世界葡萄酒的主要产地,在葡萄酒鉴定方面的研究全球领先。为了更好地控制欧洲本地市场葡萄酒产品的真实性,欧盟(EuropeanUnion)2002年发起建立“第三国葡萄酒分析参数数据库”),旨在建立全球葡萄酒原产地参数数据库,为进一步鉴定葡萄酒真伪提供数据基础。与欧洲相比,我国葡萄酒产地溯源的基础信息还很薄弱,仅在香气成分和近红外分析方面有些初步的研究。由于缺乏可靠的真实酒样,国内的研究还局限于国产葡萄酒产地溯源。因此,发展进口葡萄酒的产地溯源与鉴定技术是规范当前我国葡萄酒市场以及完善葡萄酒相关法规的前提条件。葡萄酒鉴定最核心的问题是对其葡萄酒原产地的识别。现代化学分析方法建立以前,葡萄酒的鉴定最初是由专业品酒师完成,虽然在一定程度上能为葡萄酒提供专业的真伪鉴别,但是必定带有很多主观因素。因此,建立客观标准化的鉴定方法是未来葡萄酒鉴定的发展趋势。为推动我国葡萄酒安全追溯制度的建立与完善,促进进口名牌葡萄酒产地溯源技术的研发,本文从检测指标和方法等方面来综述葡萄酒产地溯源技术的最新研究进展与应用现状,并指出我国葡萄酒产地溯源未来研究的一些重点。1国外葡萄酒产地溯源研究对葡萄酒进行产地溯源首先需要了解世界葡萄酒产区的相关信息。产地的气候条件、土壤质量和适宜种植的葡萄品种是影响葡萄酒品质的重要因素。即使是同一品种的葡萄在不同产地的阳光、温度、湿度等条件下所产出的葡萄酒也风格迥异,正是由于这些特定因素构成了葡萄酒的多元化以及原产地价值。因此,葡萄酒的产地在一定程度上决定了葡萄酒品质。由图1可知,全球主要葡萄酒产区主要分布在北纬30°~45°和南纬30°~45°附近,其中欧洲南部的葡萄酒产区分布最为密集,也是葡萄酒产地溯源研究的关键点。欧盟为了保护本地葡萄酒产品,设立了严格的葡萄酒原产地保护法规,奠定了葡萄酒产地溯源的法律基础。表1列举了世界主要葡萄酒生产国以及主要葡萄酒品牌,不难发现繁杂的葡萄酒产地和品牌给葡萄酒的产地溯源带来了巨大的技术挑战。英国葡萄酒作家Johnson率先将世界上所有的葡萄酒产区分为旧世界(oldworld)与新世界(newworld)。“旧世界”主要指法国、意大利、西班牙等有着几百年历史的传统葡萄酒酿造国家,而“新世界”则指美国、加拿大、阿根廷、澳大利亚等新大陆的新兴葡萄酒酿造国家。在欧洲的传统葡萄酒产区,众多品种的葡萄经过上千年的选择和培育能够很好地适应当地的气候和土壤。酿造过程也尽量遵循自然条件酝酿酒的滋味与风华,这样的理念一直是欧洲高级葡萄酒的精神。新世界葡萄酒的发展始于哥伦布发现新大陆,欧洲的葡萄品种随新移民潮带到当地种植,陆续传抵至南美洲和澳洲,开启了新世界的葡萄栽种与酿造。近代酿造业技术不断创新,从原初的单纯保护葡萄发酵过程的顺利进行,到现今采用高科技不断提升葡萄酒质量。因此,新世界葡萄酒更注重消费者的体验,酿造过程会更倾向于一些人为添加或者加工,以保证最大的消费者认可度。2葡萄酒生产源的技术方法2.1icp-ms测定葡萄酒含有丰富的矿质元素,其中包括K、Ca、Na、Mg等常见元素,也包括Fe、Cu、Zn、Mn等微量元素以及Pb、Sr、Cr等痕量重金属元素。这些矿物质元素主要依靠葡萄从种植地土壤吸收,因而不同产地土壤矿质元素种类和含量比例的差异具有地理地质特异性,导致葡萄酒的矿质元素组成也具有明显的地理差异。矿质元素的分析主要是利用无机质谱进行定量分析(表2),常用的有电感耦合等离子体质谱(inductivelycoupledplasmamassspectrometry,ICP-MS)、电感耦合等离子发射光谱仪(inductivelycoupledplasmaatomicemissionspectrometry,ICP-AES)、石墨炉原子吸收分光光度法(graphitefurnaceatomicabsorptionspectrometry,GF-AAS)和火焰原子吸收光谱仪(fireatomicabsorptionspectrometry,F-AAS)。与其他方法相比,ICP-MS,特别是多接收电感耦合等离子体质谱仪(multi-collectorinductivelycoupledplasmamassspectrometry,MC-ICP-MS),由于其操作简便、检测限低(10-12~10-9级别)、测定范围广、具备同位素分析能力等优点被广泛运用于葡萄酒矿质元素的指纹分析。矿质元素指纹分析应用于葡萄酒产地溯源的研究非常多。例如,Galgano等利用61种元素含量结合规范变量分析(canonicalvariateanalysis,CVA)成功的对意大利3个省生产的葡萄酒进行分类,并且找出了提供主要区分能力的矿质元素。Gonzalvez等通过38种重矿质含量分析西班牙瓦伦西亚受法律保护的原产地(protecteddesignationoforigin,PDO)葡萄酒来源,结果表明借助不同的多元分析模型(PCA、DA和分类回归树(classificationandregressiontree,CARTs)以及利用特定的矿质元素也能有效区分出不同产地的葡萄酒,并且大部分的矿质元素都可以用来进行产地溯源分析。Rodrigues等通过测定17种矿质元素对葡萄牙4个葡萄酒产区的白葡萄酒和红葡萄酒进行鉴定,调查葡萄酒产地和酒种(白葡萄酒和红葡萄酒)是否与酒标标称的信息相符,结果表明某些矿质元素不仅能区分产地而且还能区分酒种。这些研究均显示矿质元素能提供强大的葡萄酒产地溯源能力,具有很好的应用前景。然而,Trujillo等的调查研究发现,很多时候葡萄酒矿质元素含量的差异并不一定来源于土壤,而可能是酿酒设备或者加工过程中引入的,产地溯源计算时需加以甑别。因此,在利用矿质元素进行产地鉴定之前,必须考虑种植、酿造和加工过程中的信息,筛选适宜的元素进行指纹分析才能保证产地溯源结果的可靠性。2.2点特异性天然同位素及其衍生物的应用很多情况下,单一利用矿质元素指纹分析并不能很好地区分出葡萄酒的特定产区,特别是土壤性质比较接近的相邻产区。由于土壤组成成分类似,葡萄酒中的矿质元素就不能提供产地相关的信息。随着同位素质谱技术(元素分析仪-稳定同位素比例质谱仪(elementaryanalyzer-stableisotoperatiomassspectrometers,EA-IRMS)、气相色谱-燃烧-同位素比例质谱计(gaschromatography-combustionIRMS,GC-C-IRMS)、液相色谱-同位素比例质谱计(liquidchromatography-combustion-IRMS,LC-IRMS)以及点特异性天然同位素分馏核磁共振技术(site-specificnaturalisotopefractionation-nuclearmagneticresonance,SNIF-NMR)等)的发展和普及,利用稳定同位素方法进行产地溯源已取得了很好的效果。例如,Capron等利用欧盟葡萄酒数据库成功地将匈牙利、罗马利亚、捷克共和国和南非的葡萄酒区分开,准确率达到97%。稳定同位素具有整合(integration)、示踪(tracing)和指示(indication)的功能,可以从生理生态角度提供更准确、更高效的葡萄酒产地溯源能力。以下详述几种常见的稳定同位素分析方法。2.2.1甲基位点上的氢同位素差异SNIF-NMR能提供有机分子特定位点氢同位素比值。有机分子中的氢同位素比值通常与产地气候和地理条件密切相关,同时也受到植物代谢方式的影响。因此,2H-NMR被广泛用于葡萄酒的鉴定,且早在1990年欧盟就采用该方法作为官方方法来检测葡萄酒酿造过程中的掺糖行为。葡萄生长过程中利用空气中的二氧化碳和当地的水源(H2O、HDO)进行光合作用合成糖,再通过发酵产生酒精。这个过程中氢(H)同位素在有机分子中的分布变化并不是随机的(图2)。酒精的氢同位素主要有以下几种形式CH2DCH2OH、CH3CHDOH和CH3CH2OD等3种形式。通常甲基位点(—CH3)上的氢原子比较保守,主要来源于光合作用产生的葡萄糖;亚甲基(—CH2—)位点上的氢则可能来自于糖酵解过程或者是葡萄汁中的水产生的氢原子;而羟基(—OH)上的氢来源于葡萄汁中的水。因此,甲基位点上的氢同位素差异包含了不同地理起源的葡萄酒信息。最新研究指出,NMR分析不仅能区分较大尺度葡萄酒产地(不同产区),对更小尺度(酒庄)的葡萄酒产地的溯源也具有较好的应用前景。Lopez-Rituerto等通过1H-NMR技术结合区间扩展标准变量分析法(iECVA)区分了西班牙里奥哈产区3个小产区的葡萄酒,并且指出异戊醇和异丁醇是很好的指示化合物。Viggiani等利用1H-NMR对意大利Basilicata地区不同产区葡萄酒进行鉴定和溯源,得到了较好的区分效果。通过结合2H-和13C-NMR测定丙三醇特定位点的2H和13C比率,不仅可为葡萄酒的鉴定和产地溯源提供更加丰富的产地信息,也可提高更小尺度的产地溯源能力,还能同时鉴定葡萄酒加水掺糖等非法行为。虽然SNIF-NMR在研究葡萄酒产地溯源方面具有准确、高效的特点,但由于NMR设备昂贵,且操作要求高,限制了NMR方法的广泛应用。此外,葡萄代谢组学和发酵过程方面的研究相对滞后,对结果的解释往往会产生误差。已有研究指出,使用2H-NMR测定酒精D/H比率对葡萄酒进行产地溯源和鉴定的过程中并没有考虑发酵过程中不同酵母和不同发酵温度所带来的影响,可能对结果造成50%的误差。以上原因大大限制了NMR方法在葡萄酒品质鉴定与产地溯源方面的应用。2.2.2葡萄酒中13c与产物的质谱分析碳(C)和氧(O)是组成生物体的最主要也是含量最多的元素。不同物种具有不同的生理反应过程,导致了不同的同位素分馏效应。葡萄酒的酿造过程是个复杂的生物化学过程,其同位素组成与葡萄品种、种植方法、酿造工艺以及当地地质气候状况密切相关。葡萄汁和葡萄酒中的O可能来自于大气氧、二氧化碳以及植物吸收的水分,其同位素比值(δ18O)受到产地大气和水文条件的影响。同样地,葡萄酒中的碳同位素比值(δ13C)取决于光合作用固定二氧化碳的过程,与植物的光合途径(C3、C4)、环境因子(温度、湿度、降雨)以及生理因素(气孔导度、胞间二氧化碳浓度)等密切相关。这些因素的差异使得葡萄酒中的C和O同位素带有葡萄酒产地的指纹信息,可以用来进行葡萄酒产地溯源。葡萄与甜菜等大部分蔬菜水果植物通过C3光合途径(即Calvin循环)固定CO2,而玉米、甘蔗等利用C4光合途径(Hatch-Slack循环)固定CO2。由于两种光合途径固定CO2的酶(RUPB羧化酶和PEP羧化酶)产生的动力分馏值不同,导致C3植物的δ13C值分布在-36‰~-20‰之间,而C4光合作用的植物δ13C值分布在-15‰~-7‰之间。由于这两种类型的植物δ13C值没有重叠,因此碳同位素分析还可用来对葡萄酒发酵过程中掺C4糖的行为进行甄别。目前,用于测定葡萄酒产品δ13C和δ18O的目标化合物主要有乙醇、丙三醇和水。葡萄酒发酵过程中92%的糖通过乙醇发酵生成酒精,剩下8%的糖通过丙三醇-丙酮酸的发酵生成丙三醇。欧盟已将葡萄酒乙醇和丙三醇δ13C以及葡萄酒中水的δ18O值作为葡萄酒鉴定的主要指标。早期测定乙醇的δ13C需要特殊的装置和复杂的方法来获得至少92%的乙醇体积分数,而葡萄酒中水的氧同位素比值测定也需要进行充分的样品提取与纯化才能进行,如此复杂的前处理过程限制了该方法的推广应用。随着同位素质谱仪和色谱分离技术的发展,20世纪70年代末Sano等尝试将气相色谱与同位素比率质谱仪联用测定有机物的δ13C值,即GC-C-IRMS法。1997年欧盟决定采用该方法用于测定葡萄酒中的乙醇和丙三醇δ13C值,即将GC分离后的乙醇通过氦气流送入燃烧室先转化为CO2后再进入IRMS分析其碳同位素比值。此方法省略了复杂的样品前处理步骤,因而得到更广泛的应用。GC-C-IRMS仅能对葡萄酒中易挥发的组分进行分析(如乙醇、丙三醇),但对于一些难挥发或者汽化点过高的有机组分(如氨基酸、糖类以及酚类)物质则不能直接测定其同位素组成,必须将目标化合物衍生,通过GC分离再测定其同位素组成。衍生化过程会带来新加入C的干扰,因此大大降低了该方法的准确性和重现性。高效液相色谱仪(highperformanceliquidchromatograph,HPLC)能分离葡萄酒中大部分的有机小分子,但是由于有机流动相的干扰,使得HPLC很难与IRMS在线联用,必须将HPLC分离的目标化合物离线气化成CO2再进入IRMS分析,并且前处理过程不能发生同位素分馏。随着同位素质谱新一代技术的发展,现在可以利用商业化的质谱组件如FinniganLCIsoLink模块将HPLC和IRMS联用。IsoLink模块能将HPLC分离的目标化合物完全氧化成CO2,脱水后通过氦气流直接进入IRMS测定同位素比值。由于此过程为完全化学反应,因此不会产生同位素分馏。Cabanero等比较了EA-IRMS、GC-IRMS和HPLC-IRMS法测定葡萄酒中乙醇δ13C值,发现3种方法测定结果没有显著差异,并且HPLC法测试精度达到0.15‰。此后该作者又同时测定葡萄酒中乙醇和丙三醇的δ13C值,精度达到0.25‰,第一次实现了利用HPLC-IRMS同时测定乙醇和丙三醇的δ13C值。Guyon等还利用HPLC-IRMS法尝试测定葡萄酒中葡萄糖、果糖、酒精以及丙三醇的δ13C值,并认为相同来源的葡萄酒中以上4种成分的δ13C的比值应为常数。由此可见,HPLC-IRMS方法技术既省去了传统方法复杂的前处理过程,同时还能分析GC-C-IRMS法不能测定的组分,为葡萄酒产地溯源和鉴定方法提供更有力的技术支撑和新的思路,势必会展现出更大的葡萄酒产地溯源应用能力。2.2.3葡萄酒中pb同位素组成硼(B)在自然界中主要以10B和11B两种形式存在,由于不同的地球化学过程引起硼同位素的分馏,从而导致岩石、海洋沉积物和自然水体中11B/10B的变异。硼也是植物体必须的微量元素,通过根系从土壤中吸收,因此植物体内的硼同位素组成带有原产地的信息。Coetzee等通过测定比较了南非(Stellenbosch)、法国(Bergerac)和意大利(Valpolicella)地区葡萄11B/10B值,不同产地间葡萄酒硼同位素值之间的差异为0.5%~1.5%,而测定精度(相对标准偏差(relativestandarddeviation,RSD))为0.1%~0.25%,因此可以用来区分产地。锶(Sr)有84Sr、86Sr、87Sr和88Sr4种同位素,其中87Sr是由87Rb放射衰变产生的,并且在地壳中逐步积累。自然生长的葡萄通过根系吸收Sr,并通过疏导组织转运到果实,最终存在于葡萄酒中。Marisa等研究证明,葡萄酒中87Sr/86Sr比率与原产地土壤中87Sr/86Sr比值没有统计差异,说明葡萄种植以及发酵过程并不会引起Sr同位素比率的改变,显示出了良好的应用前景。但该方法现阶段还存在一些测试技术上的问题。现在测定Sr同位素多用MC-ICP-MS,比起传统的热电离质谱技术(thermalionizationmassspectrometry,TIMS)具有价格便宜,测定方便的优点,但同时也容易受到各种干扰而引起测定误差。Choi等在用Sr同位素对人参原产地进行溯源研究的时候,所测出的87Sr/86Sr比值低于自然界比值的下限,这个结果显然是不合理的。自然界87Sr/86Sr比值介于0.702~0.740之间,而根据文献报告的红酒中87Sr/86Sr比值范围介于0.71~0.73之间。因此在利用该方法时必须确保测试的准确性和精度能达到溯源的标准。铅(Pb)共有4种天然同位素:204Pb、206Pb、207Pb和208Pb。其中204Pb的半衰期非常长为1.4×107年,因此一般作为铅稳定同位素的参考物。但由于204Pb在自然界丰度较低,因此测定精度较差。206Pb、207Pb和208Pb分别为238U、235U和232Th放射性衰变的最终产物,一般以206Pb/207Pb和208Pb/207Pb作为检测指标。因此年代不同,Pb、U和Th含量不同的天然物质,其Pb同位素组成也不同。因此可以将Pb同位素作为一种“指纹”信息区分不同产地来源的产品。Dean等比较了澳大利亚和欧洲葡萄酒Pb同位素组成,表明不同地点葡萄酒中的铅具有不同的同位素组成。也有学者指出,大气沉降过程中携带的铅也能被葡萄植物吸收,而且来源于大气的铅可能要高于植物从沉积物吸收的。因此,葡萄酒中Pb同位素组成不仅包含原产地地质、气候信息,而且还能反应这一地区的污染。因此,需要更多地了解当地的环境背景才能更好地利用Pb作为产地溯源的指纹信息。稳定同位素在不同方面为葡萄酒的产地溯源提供了非常可靠的指纹信息。利用多元统计方法可以将不同稳定同位素的溯源能力进行有机结合,能提供更高效、更强大的小产区溯源能力(图3)。例如通过测定葡萄酒的(D/H)II、13C以及18O3种同位素能很好的区分斯洛文尼亚的Drava和Sava两个内陆的小产区。Horn等探讨了利用87Sr/86Sr和δ18O在葡萄酒产地溯源上的应用,并认为这两种同位素的结合能得到最优的产地溯源效果。这说明结合不同同位素在葡萄酒产地溯源方面的特殊能力,探索最优化的指标组合,从而获得最佳的溯源效果。2.3其他方法论2.3.1不同产地葡萄酒香气成分检测分析方法葡萄酒的香气主要来源于葡萄成熟以及酿造过程中产生的挥发性物质。挥发性物质的主要来自于3个阶段:第一阶段为葡萄成熟后原葡萄香气,主要与品种和成熟度有关;第二阶段是酒精发酵过程中由酶化学反应和热力学反应产生的香气,主要与发酵菌种以及酿造方法有关;最后在陈化过程中产生的香气,陈化年份为主要影响因素。因此葡萄酒香气主要与葡萄品种、成熟度、酿造方式以及年份有关。利用这些特定信息能对不同产地的葡萄酒进行分类和溯源。常用的测定葡萄酒香气成分的方法有气相色谱-质谱(GC-MS)联用以及电子鼻法。GC-MS法主要前处理方法有静态顶空、动态顶空、固相微萃取等,主要分离分析方法有GC、GC-MS、GC×GC-MS、GC-O、电子传感器等。通过对所测得的特征香气成分进行定量,结合方差分析(analysisofvariance,ANOVA)、PCA、LDA等统计方法对葡萄酒产地进行溯源。不同产地的葡萄酒除香气浓度具有差异外,成分组成上也具有明显的不同,因此,利用阵列气体传感器可以区分出不同葡萄酒产品顶空中香气成分含量差异,这种方法被称为电子鼻法。电子鼻具有检测快速,所需样品量少等优点,但是由于气体传感器对特定气体的选择度并不特别专一,因此可能引起错误的判定。尽管如此,电子鼻技术还是有一些成功的应用。例如Guadarrama等结合电子鼻技术以及PCA分析方法成功区分出了西班牙红葡萄酒、白葡萄酒以及玫瑰葡萄酒,而Penza等成功地区分了意大利不同产地的葡萄酒,正确率达到100%。2.3.2稳定同位素组成的检测由于每种分子都有由其组成和结构决定的独有的红外吸收光谱,据此可利用红外光谱对分子进行结构分析和鉴定。利用这个原理,不同葡萄酒样品能获得不同的红外光谱。在实际应用中,近红外线(nearinfra-red,NIR)和中红外线(middleinfra-red,MIR)光谱分析已获得了很好的效果。例如,Arana等利用NIR光谱对夏埃顿白葡萄酒的产地和葡萄品种、成熟度进行研究,得到了较好的结果。Liu等利用NIR和可见光谱结合多元分析区分了西班牙和澳大利亚红葡萄酒,准确率达到72%~85%。Picque等利用MIR对红酒的产地和葡萄采摘年份进行了区分。Fernández等利用傅里叶变换中红外线光谱仪(Fouriertransforminfraredspectrometer,FT-MIR)对红酒中的单宁含量进行定量分析,并尝试对红酒质量进行评估。虽然红外光谱法具有快速高效、多组分测定以及无损分析等优势,但是红外光谱法也有一定的局限性,比如大多数目标化合物具有相似的红外吸收光谱,并且容易受到葡萄酒中主要成分(水、乙醇)的影响。特别是对葡萄酒中多酚进行检测时,以上两种情况都会影响到葡萄酒产地判别的准确性。总之,目前为止还没有一种方法能独立对市场中的葡萄酒进行产地溯源。多方法多技术的结合,相互取长补短将是对小产区葡萄酒产地进行溯源的有效方案,特别是多元素同位素组成分析。此外,稳定同位素技术由于其精度高、无需复杂前处理过程等特点,有望成为产地溯源与鉴定的标准方法。HPLC-IRMS技术的发展大大扩展了特定分子的同位素组成的测定,具有广