一种含新霉素磷酸转移酶的重组逆转录病毒的浓缩方法

一种含新霉素磷酸转移酶的重组逆转录病毒的浓缩方法

作为一种真正的细胞遗传遗传因素转移的载体系统之一，病毒反演反演过程病毒以其高效感染主细胞，稳定整合到主细胞组，并将其传给后细胞。同时，高度感染的病毒数量也是确保在转移基因转移研究中更好地应用于迁移率等。因此，病毒反演过程中的病毒筛选减少，体积减少，滴度增加，已成为推动转型反演过程体系研究的重要方面。本研究旨在通过差速离心、滤膜截留两种方法的比较及条件的优化,建立可行、高效的重组逆转录病毒的浓缩方法,获得带有标记基因的、具有理想感染滴度的重组逆转录病毒载体系统,从而为使用该系统进行转基因研究奠定了坚实的基础。1材料和方法1.1菌株和培养基含有新霉素磷酸转移酶Ⅱ(Neor)重组逆转录病毒载体pLXSN及用于感染靶细胞NIH3T3细胞由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室孟庆文博士惠赠。大肠杆菌DH5α为本室保存菌种。包装细胞系PA317细胞由本室保存,PA317和NIH3T3细胞均用含10%小牛血清的DMEM营养液增殖,维持液为含2%小牛血清的DMEM营养液。工具酶、一般试剂及培养基均购自Promega公司与Takara公司。脂质体Lipofectin、G418均为GIBCO公司产品。Centricon-30浓缩器为Millipore公司产品。SCP55H型超速冷冻离心机,日立公司产品。日本电子GJEM1200EX2型透射电镜,本校中心实验室提供。1.2方法1.2.1病毒载体的检测按文献方法进行1.2.2dmem—G418对于PA317细胞的最小致死剂量的测定24孔板接种适量的PA317细胞,次日,待其长成50%左右时,加入G418浓度分别为300、400、450、500、550、600、700、800μg/ml的DMEM—10营养液,每日观察细胞状态,大约一周后,根据细胞死亡情况确定G418对于PA317细胞的最小致死剂量。1.2.3病毒载体的筛选参照Lipofectin说明书及文献,用Lipofectin及磷酸钙两种介质将病毒载体导入包装细胞系PA317,并以最小致死剂量的G418进行筛选。1.2.4病毒浓缩方法将得到的G418抗性克隆在含有G418(300μg/ml)的选择培养液中扩大培养,收毒前一天将阳性细胞1∶4分传,细胞贴壁后,加入半量的、新鲜的完全培养液,2—3天后收取培养上清。差速离心法浓缩病毒具体步骤为4℃,10000rpm(6,250×g)离心15min,弃沉淀,上清于4℃,80,730×g离心2h,离心管置于冰浴条件下,1%体积的完全营养液回悬沉淀,回悬时使用同一吸管以避免损失,约每15min吹打一次,避免产生气泡(气泡的产生会使病毒蛋白变性)。滤膜截留法浓缩病毒具体步骤为:将上清加入Centricon-30浓缩器,4℃,6,250×g离心10min,弃去滤液,用回收管封闭滤器,倒置,4℃,6,250×g离心10min,回收浓缩液。电镜观察收取浓缩病毒,2%磷钨酸负染,透射电镜观察。1.2.5g218对nih3t3的最小致死剂量24孔板接种适量的NIH3T3细胞,次日待其长成50%左右时,加入含有G418浓度分别为300、400、500、600、700、800、900、1000μg/ml的DMEM—10营养液,每日观察细胞状态,大约一周后根据细胞死亡情况,确定G418对于NIH3T3的最小致死剂量。1.2.6polyhene病毒的感染途径培养参考文献,用改进的方法进行滴度测定。具体步骤为:感染前1天将NIH3T3细胞按1万/孔接种24孔板,过夜。感染当天,移去培养液,加入低血清培养液1ml(含病毒上清0.1μl、1μl和5μl),加800μg/ml的polybrene储液至终浓度4μg/ml。37℃感染1—3h。加入低血清培养液1ml,将polybrene稀释至2μg/ml,培养48h。用选择培养液1∶4分传NIH3T3细胞,培养3天。换含G418最小致死剂量的选择培养液(含G418)。共培养7—10天后。待克隆出现时,进行克隆计数。根据公式:滴度(RCFU)=克隆数×稀释度×10,计算滴度。2结果2.1多元双酶切鉴定经KpnⅠ单酶切得到2.75kb、3.1kb两条带,经HindⅢ、XbaI双酶切得到了1.6kb、4.2kb两条带(鉴定结果见图1)。2.2g418对pa317细胞的最小致死量的测量G418对于PA317的最小致死剂量为0.3g/L。2.3基于plxsn抗性克氏原螯虾的转染效果用脂质体Lipofectin介导与磷酸钙介导两种方法,经多次转染,0.3g/LG418筛选,得到了多个整合有pLXSN抗性克隆(相同条件下,两种方法的转染效果的比较见表1)。2.4病毒的采集和电看病毒的浓缩液在透射电镜下观察,观察到了具有逆转录病毒形态特征(球形,有囊膜,直径平均约为100nm)的病毒粒子(见图2)。2.5g418对nih3t3细胞的最小致死量的测量G418对于NIH3T3细胞的最小致死剂量为0.5g/L。2.6比较前后病毒浓度的逆模式病毒感染流度结果见表23第二代溶剂系统的筛选在逆转录病毒介导的基因转移中,经常选用标记基因(Neor,LacZ等)来追踪被标记细胞,本实验以Neor作为显性标记基因。具有易于筛选、无内源性等优点。骨架为Moloney小鼠白血病病毒的逆转录病毒载体中,只含有病毒基因组5′、3′两端的长末端重复(LTR)序列(包括启动子、增强子和整合必需的序列)和Ψ信号(含有结构蛋白进行包装的结合序列和病毒外壳蛋白mRNA的剪接信号)。本研究选择的载体属于骨架为MoMLV的载体系列,在实践中已得到广泛应用,克隆有目的基因的病毒载体需要包装细胞的包装才能成为成熟的病毒粒子,包装细胞的染色体上以前病毒的形式整合有逆转录病毒顺式缺陷的全部结构基因,可表达病毒结构蛋白,并将载体RNA包装起来。另外,本研究选用的包装细胞系PA317,属于第二代包装细胞系,含逆转录病毒PAM3基因组,除Ψ信号缺失外,5′LTR部分缺失,3′LTR被SV40的poly(A)信号取代,这种包装结构与载体结构只有经过二次独立的重组才可能形成有复制能力的野生型病毒,因此其安全性高,而且PAM3的env来自4070A双嗜性(amphotropic)逆转录病毒,可产生双嗜性(amphotropic)病毒颗粒。在转染包装细胞的试验中,本研究运用了脂质体Lipofectin与磷酸钙两种介质,根据G418抗性细胞克隆的数目,比较两种方法的转染效率,结果表明,脂质体介导法要优于磷酸钙介导法。对于靶细胞而言,病毒受体的丰度以及细胞的生长状态是影响重组逆转录病毒体外感染的两个主要因素。我们选择处于对数生长期、鼠源的NIH3T3,来满足这两个条件,从而为通过体外感染靶细胞以测定重组逆转录病毒的滴度提供了基本保证。由于细胞数目等方面的因素,为了保证重组逆转录病毒滴度测定的精确性,在使用病毒溶液对靶细胞进行感染时,除了要设置平行样品之外,我们还设置了多个不同稀释倍数进行滴定,以获得可计数的克隆数,得到精确的滴度值,经过多次摸索,我们发现,在24孔板(1ml营养液)进行重组逆转录病毒的滴度测定时,加入0.1μl、1μl、5μl的病毒100倍浓缩液,在计数克隆时,即可获得较为理想的结果,而加入0.01μl、100μl病毒浓缩液时,则很难获得理想的克隆计数结果,因此不能获得精确的滴度值。差速离心法是分离提纯病毒的有效方法之一,本研究先用中速去除病毒上清中较大的细胞碎片及其它较大的杂质,然后选择80,730×g进行超速离心,并且尽量保证所有操作在低温下进行,浓缩前后重组逆转录病毒的感染滴度比较结果表明,采用该方法基本不影响病毒的滴度。而滤膜截留法尽管简化了操作步骤并缩短了操作时间,避免了操作中可能发生的病毒粒子数目的减少与病毒蛋白的变性,但由于滤器滤膜吸附了一定数量的病