美国临床实验室标准化委员会ccls产孢丝状真菌抗真菌药物敏感性试验方案2013-2015年版

美国临床实验室标准化委员会ccls产孢丝状真菌抗真菌药物敏感性试验方案2013-2015年版

美国临床实验室标准委员会（rcis）于1997年版推出了一种用于分解发酵菌的液体培养基（全量法和微带法）的抗真菌药物敏感性试验方案m27-a。该方案准确性高、重复性好,实验室间结果的一致性可以与抗细菌的药物敏感试验相媲美。之后,NCCLS1998年版又提出了关于产孢丝状真菌的抗真菌药敏试验倡导方案M38-P。该方案包括微量液基稀释法与多量液体培养基稀释法,适用于曲霉菌、镰刀菌、波氏霉菌等丝状真菌,一致性好。近年来,NCCLS在该方案的基础上,又在某些药物的最低抑菌浓度(MIC),即MIC值的判定等因素方面进行了广泛深入的多中心研究,加上新型三唑类药物的问世和临床应用的逐渐增多,于是NCCLS在2003年新版中又推出了产孢丝状真菌抗真菌药物敏感性试验方案,即M38-A,简介如下。一、试验中的真菌受试真菌包括:曲霉菌属、镰刀菌、根霉菌、波氏假阿利霉菌,以及申克孢子丝菌的菌丝相;不包括双相真菌的酵母相。二、抗真菌药物1.药品不使用药物抗真菌药物系自生产厂家直接购买的药物粉末,不能使用药店药物或其他临床制剂;药物粉末按厂家建议储存,或存于-20℃、甚至更低温度的干燥器(最好是真空干燥器)。2.抗真菌药物粉末及其溶剂的称重应根据该药物的分析含量进行称重;计算药物质量或制备标准溶液所需溶剂体积的公式同M38-P方案。3.抗真菌药物的测试抗真菌药物的储存液的浓度至少为1280μg/ml,或10倍于其最高测试浓度。但有些药物因其溶解度比较低,只能配制较低浓度母液,在这种情况下,应当参考厂家提供的资料判定其溶解度。非水溶剂的应用:非水溶性药物(包括原有三唑类药物、两性霉素B以及新型三唑类药物)应当用二甲亚砜(DMSO)、乙醇、聚乙二醇和羧甲基纤维素等非水溶剂进行溶解,这些药物必须以至少100倍以上的所需测试浓度进行溶解,每一种中间溶液均须用相同的稀释剂稀释至所需的浓度。溶剂的终浓度必须低于1%。过滤:储存液通常是无菌的;如果需要进行灭菌,可以用滤膜过滤,禁用有可能吸附抗真菌药物的滤纸、石棉或烧结玻璃滤器。储存:将无菌母液小量分装至无菌聚丙烯小管,小心密封后存于-60℃或更低温度,直至使用当日取出,任何未使用完的药物应予丢弃;禁止放于-20℃以上。大多数抗真菌药物在-60℃或以下存放6个月或更长时间而不丧失活性。测试浓度:基于以往的研究结果,测试药物的浓度范围如下:两性霉素B,0.0313～16μg/ml;氟胞嘧啶,0.125～64μg/ml;酮康唑,0.0313～16μg/ml;伊曲康唑以及新型三唑类药物,0.0313～16μg/ml;氟康唑,0.125～64μg/ml。培养基:使用RPMI-1640液体培养基(含谷氨酰胺,不含碳酸氢盐,含有酚红作为pH值试剂),以终浓度为0.165mmol/L的MOPS为缓冲液,该液基在25℃时pH为7.0±0.1。三、测试方法1.稀释剂和抗真菌药物的稀释使用一次性使用的无菌96孔板进行药敏检测;对于每种受试真菌,使用不含抗真菌药物的RPMI-1640孔作为生长对照孔;首先吸取所有的稀释剂,在第一管中加入药物的储存液,顺次进行倍比稀释;因为接种的真菌菌悬液与抗真菌药物等体积,所以加入板中的抗真菌药物工作浓度将是终浓度的2倍。对于不溶于水的抗真菌药物,如酮康唑、两性霉素B以及伊曲康唑,应当在适当的溶剂中配制成最大终浓度的100倍,然后再用RPMI-1640稀释50倍(这样就能保证溶剂的终浓度在1%以下)。2.接种悬液浓度的确定大多数真菌必须在35℃用土豆葡萄糖琼脂培养基(PDA)活化7d,镰刀菌必须在35℃孵育48～72h后,在25～28℃孵育至第7d;在孵育7d的菌落上加入含有0.01ml吐温20的0.85%盐水1ml,制备悬液。菌悬液静置3～5min后,大颗粒沉于底部,取上层均质液体(含孢囊孢子或分生孢子以及菌丝片段)至无菌小管,振荡15s,用分光光度计调整菌悬液浓度;曲霉菌、申克孢子丝菌A值调整至0.09～0.11(80%～82%透光率);镰刀菌、波氏假阿利霉菌以及根霉菌A值调整至0.15～0.17(68%～70%透光率);然后以RPMI-1640液体培基稀释50倍;波氏假阿利氏霉菌接种悬液应以较低的(50%)稀释倍数接种,1∶50稀释后得到2倍终浓度的接种悬液,其浓度为0.4～5×104CFU/ml。接种量可以通过在沙堡弱葡萄糖琼脂培养基(SDA)上接种0.01ml1∶100稀释度的菌悬液来准确计数。3.年生陈虫菌对mic的浓度所有的96孔板在35℃静置孵育;根霉菌21～26h后判读MIC,镰刀菌、曲霉菌属以及申克孢子丝菌在46～50h判读MIC,波氏假阿利霉菌在70～74h判读MIC。4.药物代谢mic是肉眼可见的抑制真菌生长的MIC值;一般而言,读取MIC值时,应当在阅读镜的辅助之下,将每个受试孔中真菌的生长情况与生长对照孔相比较,进行评分:4分示:生长无抑制;3分示:生长轻微减少或相当于生长对照的75%;2分示:生长明显减少或相当于生长对照的50%;1分示:轻微生长或相当于生长对照的25%;0分示:肉眼观察澄清或未见生长。两性霉素B:对于两性霉素B,MIC值判定为没有可见生长(读数为0)的最低药物浓度。若出现两性霉素B拖尾的情况,临床上可能表现为耐药。氟康唑、酮康唑或氟孢嘧啶:对于唑类如氟康唑、酮康唑,以及氟孢嘧啶,其MIC值判定为相当于生长对照有50%或更多的生长减少时的最低药物浓度。伊曲康唑:对于伊曲康唑以及新的三唑类药物,MIC值判定为100%抑制生长,即读数为0时的最低药物浓度;这类药物对于曲霉菌属以及其他条件致病性丝状真菌出现拖尾时,可能反映在临床上为相对耐药。5.子或孢囊分离层析生养成分测定用大量稀释法测试时,用RPMI-1640液基将100倍药物终浓度的储存液稀释10倍,达到终浓度的10倍。储存液的制备与上述方法相似。孢子或孢囊孢子悬液用振荡器混匀15s,用培基进行1∶100稀释,达到测试浓度(0.4～5×104CFU/ml)。将0.1ml的10×终浓度的药液加入12mm×75mm的无菌管中,-70℃冻存,6个月以上而不出现药物降解;每管在测试当天接种0.9ml真菌稀释悬液;生长对照为0.1ml不含药物的药物稀释液加0.9ml的接种悬液。上述试管在35℃静置孵育;MIC值的判读与微量液体培养基稀释法程序相同。6.药物浓度检测用终点比色法可以增强不同实验室之间伊曲康唑MIC值判定的一致性。加入2倍浓度的比色指示剂(改良刃天青)至2×浓度的标准RPMI-1640液体培养基,然后按上述程序操作。对于比色法,需观察加样孔的颜色,蓝色表示无菌生长;紫色表示部分生长;红色表示生长。唑类药物MIC值即颜色由蓝色到紫色轻微改变时的最低药物浓度;而对于两性霉素B,MIC即为无颜色改变的(均呈蓝色)或第一孔保持蓝色时的MIC。7.培养基及试验设备的质量控制每次试验均须进行质控菌株的检测,其目的在于监测药敏试验的准确度、精密度、所用试剂、测试条件以及仪器的情况,保证试验者的操作以及结果的准确客观。包括培养基及试验用器皿的质控;每次试验、每批培养基、试验用试剂器皿均需用质控菌株或参考菌株进行测定,其MIC值应在规定范围内(表1)。四、抗菌药物的致死量与M38-P方案相比,M38-A方案在如下几个方面进行了调整:首先,受试的抗真菌药物中增加了新型三唑类药物posaconazole、ravuconazole、voriconazole,与这些药物在系统性丝状真菌感染中越来越多的应用密切相关;其次,在终点判读时,将伊曲康唑的MIC值定义为100%生长抑制,即读数为0时的最低药物浓度,其原因是伊曲康唑和其他新型三唑类药物,与氟康唑和酮康唑不同,判读终点时不存在拖尾;第三,质控菌株在原有近平滑念珠菌ATCC22019和克柔念珠菌ATCC6285的基础上,增加了参考菌株黄曲霉菌ATCC204304和烟曲霉菌ATCC204305;质控药物也有相应的增加。M38-A方案是一个测定丝状真菌对不同抗真菌药物敏感性的标准化程序,制定该方案的目的是希望经过相同的标准化程序,使不同实验室获得的药物敏感性结果具有可比性或者可重复性。动物实验还证实,M38-A方案获得的体外抗真菌药物敏感性试验结果,与体内疗效之间具有良好的一致性。尽管M38-A中的受试真菌只有曲霉菌属、镰刀菌、根霉菌、波氏假阿利霉菌和申克孢