番茄组织培养与再生体系的优化

番茄组织培养与再生体系的优化

番茄是番茄科的一种一级或二级植物。作为一种全球蔬菜，它在扩大了互补物质资源方面取得了巨大成功。另一方面，它是一种广泛种植，另一方面，它在遗传理论上进行了深入的研究，为补充互补物质提供了坚实的基础。近年来,随着植物转基因技术的发展,外源基因转入番茄的研究也越来越多,这不仅使人们获得了农艺性状改良的番茄新品种(如抗虫、抗病、抗除草剂、抗逆、果实的延熟保鲜等),而且利用植物转基因技术还可使番茄作为生产食用疫苗的生物反应器.当前,在植物基因工程技术中,多数成功的转化体系都是建立在良好的组织培养系统基础之上的.自人类首次利用根诱导培养出的愈伤组织获得再生植株以来,国内外研究者们又相继从各个不同角度对番茄的组织培养体系进行了研究,但这些报道中,有的培养周期长,有的培养基复杂,有的外植体取材受季节限制等等.如将这些培养方案用于番茄的遗传转化,就会影响转化效率和结果.笔者就几种影响番茄组织培养体系建立的重要因素如供体基因型、激素浓度、培养条件等作了初步研究,建立了一套优化的番茄组织培养与再生体系,为下一步进行番茄的遗传转化打下了良好的基础.1材料和方法1.1外植体的选择番茄品种选用购自中国农业科学研究院蔬菜花卉研究所的毛粉802、串株樱桃番茄、美丽樱桃番茄、黄梨樱桃番茄、红梨樱桃番茄、中杂9号、中蔬6号、丽春番茄、中杂8号、中蔬4号、中蔬5号共11个品种的子叶、下胚轴段、叶片、茎段做为外植体.1.2培养基产品1.2.1,5-ba1的添加量P1:MS+IAA0.2mg·L-1+6-BA1.0mg·L-1;P2:MS+IAA0.5mg·L-1+6-BA1.0mg·L-11.2.2l-1+6-ba1.0.0.2P3:MS+IAA0.02mg·L-1+6-BA1.0mg·L-1;P4:MS+IAA0.05mg·L-1+6-BA1.0mg·L-11.2.3生根培养基1/2MS+蔗糖3%+琼脂0.7%+IBA1.0mg·L-1.1.3培训条件25℃,暗培养箱诱导出愈伤组织后转入光照14h,温度(25±2)℃诱导分化培养.1.4诱导愈伤及诱导愈伤将番茄种子用70%酒精浸泡30s,无菌水冲洗1次,再用0.1%升汞溶液浸泡8min,用无菌水冲洗4～5次.接种到1/2MS培养基上,28℃暗培养箱培养,发芽后转到光下培养至两片子叶完全展开.取无菌苗的子叶、下胚轴段、叶片和茎段做外植体,外植体大小0.6cm左右,接种到诱导愈伤培养基上.25℃,部分材料置于暗培养箱诱导愈伤,部分置于光下诱导愈伤,比较其影响,愈伤产生后转到分化培养基上并接受14小时/天的光照,分化培养出的苗长到1.5cm后转入生根培养基中,生成发达根系后,揭开培养膜往三角瓶中倒入少许水接受炼苗,3～5d后洗去苗根部的培养基后转入土壤中成为正常植株,并能开花结果.2结果2.1培养基的诱导分化IAA和6-BA是目前在番茄组织培养中常用的两种激素.其浓度配比对11种番茄外植体的愈伤组织的形成及分化的影响见表1,从表中可以看出,11种番茄子叶、下胚轴段、叶片、茎段对植物激素的要求存在一定的差别,11个品种的外植体的愈伤诱导率为100%,但当6-BA的浓度为1.0mg·L-1时,中蔬9号在P3上,丽春番茄在P4培养基上生长较好,分化率分别为95%,100%.而中蔬5号在P3上、中蔬4号在P4上、红梨樱桃番茄在P4培养基上获得相对较高的分化率,分别为90.9%,83%,84%.从表1的实验结果还可以看出,11个品种在不同的愈伤组织诱导及分化培养基上虽然都以较高的频率形成愈伤组织,但分化率却存在很大差别,从36%到100%不等,其中以中9、丽春为最好,而且不同品种在不同培养基上形成的愈伤组织大小及形态也不尽相同,在IAA浓度较高的培养基上所形成的愈伤组织块小且有的颜色发白,有的愈伤组织都长出白色须根.但在转入IAA浓度低的培养基上后,愈伤很快变绿,先出现许多绿点,逐渐长大,大约1周左右就有丛生芽分化,且数量较多.这是因为生长素与分裂素比值大时有利于愈伤的形成,比值小时有利于细胞的分化.2.2蔗糖浓度对愈伤组织的诱导分化效果从表2中可以看出在不含蔗糖的培养基上,外植体不能形成愈伤组织,逐渐白化死亡.而在含有不同蔗糖浓度的培养基上,随着蔗糖浓度的升高,外植体形成愈伤组织的百分率逐渐升高,在30～50g·L-1蔗糖的培养基中,愈伤组织形成率均为100%.蔗糖浓度不同时,愈伤组织大小及形态也不尽相同.蔗糖浓度为10g·L-1时,只在子叶边缘形成少量的愈伤组织,分化能力也很低,分化率仅为35%.当蔗糖浓度升至20～30g·L-1时,外植体边缘形成较多的白色颗粒状愈伤组织,并能够正常分化,但以30g·L-1的蔗糖浓度分化率最高,可达100%.当蔗糖浓度继续升高,达到40～50g·L-1时,虽然都能诱导出愈伤组织,但愈伤组织块却明显变硬且颜色变褐,只有部分愈伤组织能分化,当浓度为50g·L-1时,分化率已降至23%.2.3光照培养成因从表3中看出,不经过暗培养,直接在光照条件下进行愈伤组织诱导,只有部分外植体能形成愈伤组织并且分化率低.如果将外植体暗培养10天,在外植体边缘开始形成愈伤组织时进行光照培养,愈伤组织都可分化.随着暗培养时间的延长,愈伤组织虽可不断生长,但却逐渐失去了分化能力.在暗培养30天后转入光照培养,只有27%的愈伤组织能分化,很多的则褐化死亡.3讨论3.1选择合适的基因型大量研究证明,基因型是影响番茄组织培养效果的重要因素.在相同培养基上,不同的番茄品种间存在着不同的分化率,只有中蔬9号和丽春番茄在P3、P4培养基上获得了最高的愈伤组织分化率,而其它几个品种虽然在这几个培养基上也能形成愈伤组织,并能不同程度的分化,但要获得最大的分化率和芽再生率,还需进一步调整培养基中的植物激素种类与浓度,因此,选择合适的基因型在番茄组织培养中尤为重要.3.2不同的植物生长剂用量对番茄外植体再生频率的影响在植物组织培养中,外源激素的使用是必不可少的,已有许多的研究证明,IAA和6-BA结合使用会提高番茄外植体的再生频率,但由于所选用品种不同,其用量也有很大差别.3.3蔗糖浓度对植物的影响蔗糖作为植物组织培养中的碳源,既可作为营养来源,又可作为渗透调节剂.实验结果表明,选择合适的蔗糖浓度对植物的组织培养非常重要.蔗糖浓度过低,不能使光合作用有效地进行,在愈伤组织中累积的淀粉量不足以使其全部分化,甚至不能分化成苗.而蔗糖浓度过高会使培养基中的渗透压过高,对植物材料产生毒害作用,在某种程度上抑制细胞的分化,进而影响分化结果.3.4暗培养时间对番茄外植体分化的影响因为植物材料是在含糖的培养基上进行培养的,所以光照的作用主要是诱导形态建成.它涉及到植物细胞分化的若干重要过程.光可能通过光合作用在特殊的细胞里累积淀粉,并经一定量的淀粉聚集,直接或间接地扣动了器官发生的光诱导扳机.暗培养的主要目的是使外植体脱分化,产生一定量的愈伤组织.从表3的结果可以看出,在完全光照条件下培养番茄外植体只能诱导出少量愈伤组织,因此这些愈伤组织累积的淀粉量也很低,有的甚至无法启动愈伤组织的分化,所以完全光照条件下诱导的愈伤组织的分化率很低.而暗培养时间过长,虽可使愈伤组织大量生长,但由于大部分糖都用于愈伤组织的增殖,即使转入光照条件下,仅通过光合作用在愈伤组织中累积的淀粉也是有限的,只能使很少的愈伤组织能产生芽原基,因此分化率下降.可见