分子诊断学：第九章 核酸分子杂交技术试题及答案

第九章核酸分子杂交技术试题A型题：要探知细胞内某一蛋白质的表达水平，可以通过_______实现。SouthernblotNorthernblotWesternblot原位分子杂交核酸的变性是_______。一级结构的断裂二级结构的破坏伴有共价键的断裂是DNA的降解过程。固相杂交不包括_______。Northern印迹杂交原位杂交吸附杂交Southern印迹杂交染色体原位杂交结果如图所示羊水细胞间期核与13、18、21、X和Y染色体的DNA探针杂交。左图显示细胞核与13号染色体（绿）和21号染色体（红）的探针杂交。右图显示细胞核与18号染色体（浅蓝）、X染色体(绿)和Y染色体（红）的探针杂交。请根据该结果得出诊断为_______。21三体女性胎儿染色体微缺失正常男性胎儿染色体原位杂交结果如下图左图：用13号染色体（绿）和21号染色体（红）的探针与来自羊水的间期细胞杂交，右图：用18号染色体（浅蓝色）、X染色体（绿）和Y染色体(红)的探针与羊水细胞杂交。针对该检测结果判断疾病为_______。男性21三体女性21三体DiGeorge综合症正常胎儿荧光原位杂交结果如下图X染色体着丝粒探针（Xcen）和Xp22.3探针都用红色荧光标记，根据该结果可诊断为_______。染色体微缺失21三体男性胎儿正常女性胎儿荧光素FITC是_______。异硫氰酸荧光素四乙基罗达明德克萨斯红吲哚二羧菁B型题着丝粒探针染色体涂抹探针基因座特异探针端粒重复序列探针可用于中期及间期细胞，检测染色体的非整倍性可用于中期及间期细胞，检测微缺失和微重复可用于中期及间期细胞，检测染色体的非整倍性和端粒微小末端重排只能用于中期细胞，确定小标识染色体或畸变重复序列探针固相杂交液相杂交Western印迹FISHRx-FISH菌落原位杂交斑点和狭缝杂交Southern印迹杂交Northern印迹杂交复性速率液相杂交吸附杂交发光液相杂交液相夹心杂交原位杂交DNA的浓度DNA的大小和复杂性温度离子强度影响DNA复性的因素影响DNA变性的因素影响核酸分子杂交的因素X型题根据性质及来源不同，核酸探针又可被分为基因组DNA探针DNA探针RNA探针寡核苷酸探针等常用的核酸探针非放射性标记物有地高辛生物素酶荧光素系统常用的核酸探针荧光素标记物有异硫氰酸荧光素四乙基罗达明德克萨斯红吲哚二羧菁等非放射性探针检测方法有直接法间接免疫法直接亲合法间接亲合法等Southern印迹技术是检测RNA的核酸杂交技术是以发明者的名字命名的属于固相杂交的范畴可用于遗传病的检测Northern印迹技术是检测RNA的核酸杂交技术是以发明者的名字命名的属于固相杂交的范畴与Southern印迹杂交的方法类似，只是变性剂不同核酸原位杂交是核酸分子杂交技术与组织细胞化学和免疫组织化学结合起来的一种杂交方法，基本原理及探针的标记方法与传统核酸分子杂交技术相同不能确定与探针互补的核酸序列在细胞内的空间位置不需要将核酸从细胞中提取出来荧光原位杂交的标本中期染色体间期核完整细胞或组织切片最广泛应用的标本是中期染色体液相分子杂交包括吸附杂交发光液相杂交液相夹心杂交复性速率液相分子杂交名词解释核酸分子杂交核酸探针Southern印迹Northern印迹Western印迹染色体原位杂交重复序列探针单一序列探针全染色体涂抹探针基因座特异探针变性复性增色效应杂交反应的严格度退火FISHRx-FISH问答题原位杂交的基本原理简述原位杂交在临床中的应用。简述临床诊断常用的FISH探针的类型及用途。举例说明FISH技术在分子诊断上的应用。M-FISH的原理及其优缺点。参考答案一、1、C2、B3、C4、D5、B6、A7、A二、1.A2.C3.C4.B5.AD6.A7.A8.A9.A10.B11.B12.B13.B14.A15.ABCD16.CD17.ABCD三、1．ABCD2.ABCD3.ABCD4.ABCD5.BCD6.ACD7.ABD8.ABCD9.ABCD四、名词解释核酸分子杂交：不同来源的单链核酸分子在合适的温度和离子强度下，通过碱基互补形成双链杂交体的过程称之。核酸探针：是指能与待检测的靶核酸序列互补杂交的某种已知序列的核酸片段。它具有高度的特异性，并且一般来讲带有某种适当的标记以便检测。Southern印迹将待检测的DNA样品固定在固相载体上（硝酸纤维素膜或尼龙膜），与标记的核酸探针进行杂交，在与探针有同源序列的位置上显示出杂交信号。通过Southern杂交可以判断被检测的DNA样品中是否有与探针同源的片段以及该片段的长度。Northern印迹指RNA经电泳分离后转移至膜性支持物上进行杂交反应的技术，目前主要用于检测某一组织或细胞中已知的特异mRNA的表达水平以及比较不同组织和细胞的同一基因的表达情况。Western印迹Western印迹又称免疫印迹(immunoblotting)，是一种通过标记的抗体检测经SDS分离的特定蛋白质的技术。染色体原位杂交荧光原位杂交可以检测非分裂期即间期细胞核的染色体的数量及结构异常这种方法称为染色体原位杂交（chromosomeinsituhybridization），是FISH优于传统细胞遗传学技术的重要特点。重复序列探针是指与某一条特定的染色体结构结合、特异识别重复DNA序列的探针如着丝粒探针、端粒探针等。单一序列探针指能与位于某条染色体特定的区域或基因的单拷贝DNA序列杂交的探针。全染色体涂抹探针来源于一条染色体的DNA文库，这种探针可以识别一条特定染色体全长上的单一序列，从而将一条完整的染色体染色而得以显示（painting）。基因座特异探针是与染色体上某一特定基因的单拷贝DNA序列杂交的探针。当已经分离到一个基因的一小段，想检测该基因定位于哪条染色体时，应用该探针。变性当有酸、碱、热及某些变性剂（如尿素、乙醇、甲酰胺、胍等）等因素存在时，DNA分子双链间的氢键断裂，解离成两条无规则的卷曲状单链DNA，此现象称之。复性去除变性因素后，单链DNA可通过碱基互补重新结合成稳定的双链螺旋结构，此过程称为复性（renaturation）。增色效应DNA变性后，由于双螺旋解体，碱基堆积不再存在，藏于螺旋内部的碱基暴露出来，从而使变性后的DNA对260nm紫外光的吸光率比变性前明显增加，这种现象称之。杂交反应的严格度在杂交反应中容许错配的程度称之。退火当热变性DNA缓慢冷却时，可以复性，这种复性称之。FISH是一种利用非放射性的荧光信号对原位杂交样本进行检测的技术。它通过荧光标记的探针与待测标本的核酸进行原位杂交，在荧光显微镜下对荧光信号进行辨别和计数，从而对染色体或基因异常的细胞、组织标本畸形检测和诊断。Rx-FISHRx-FISH技术是采用多种荧光素混合物标记与人类DNA有高度同源性的猿或其它灵长类动物的DNA作为探针，杂交后使人类的24条染色体呈现特异的带型，根据彩色的荧光条带进行核型分析。五、问答题原位杂交的基本原理样本经适当处理后，使细胞通透性增加，让探针进入细胞内与组织、细胞中待检测的核酸进行特异性结合形成杂交体，然后通过组织化学或免疫组织化学方法在被检测的核酸原位形成的杂交信号，在显微镜或电子显微镜下对待测核酸进行细胞内定位的方法。简述原位杂交在临床中的应用原位杂交技术可以通过标记的探针与分裂中期染色体DNA杂交来精确定位特定核苷酸序列在染色体上的位置；与细胞RNA杂交可观察组织细胞中特定基因的表达水平；还可用特异性的细菌或病毒的核酸序列作为探针与组织、细胞杂交，以确定有无病原体的感染等。原位杂交能在成分复杂的组织中对单一细胞进行研究，不受同一组织中其它成分的影响，因此对于那些细胞数量少且散在于其它组织中的细胞内DNA或RNA的研究更为方便。此外，原位杂交不需要从组织中提取核酸，有利于检测组织中含量极低的靶序列，并可完整地保持组织和细胞的形态，更能准确地反应出组织细胞的相互关系及功能状态。举例：原位杂交检测上皮细胞中人乳头状瘤病毒（HPV）DNA简述临床诊断常用的FISH探针的类型及用途。根据核酸探针的序列特点，可将FISH探针分为三大类：重复序列探针、单一序列探针和全染色体涂抹探针。重复序列探针（repetitivesequencesprobes）是指与某条特定的染色体结构结合、特异识别重复DNA序列的探针如着丝粒探针、端粒探针等。一般来说，不同的染色体，着丝粒重复序列中的核苷酸序列也不同，但端粒重复序列不具有染色体特异性。单一序列探针(Uniquesequenceprobes)与某条染色体上特定的区域或基因的单拷贝DNA序列杂交。包括带特异性探针（bandspecialprobes）和基因座特异性探针（LocusSpecificprobes）等。全染色体涂抹探针（wholechromosomepaintingprobes,WCP）是识别一条特定染色体全长上的单一序列探针的混合物。种类主要应用着丝粒探针（centromericprobes）可用于中期及间期细胞，检测染色体的非整倍性染色体涂抹探针（Chromosomepaints）只能用于中期细胞，确定小标识染色体或畸变基因座特异探针(LocusSpecificProbes)可用于中期及间期细胞，检测微缺失和微重复端粒重复序列探针（Telomere-repeatprobes）可用于中期及间期细胞，检测染色体的非整倍性和端粒微小末端重排举例说明FISH技术在分子诊断上的应用21三体，微缺失，肿瘤，病原微生物等的检测与诊断。M-FISH的原理及其优缺点混合数种荧光原色，形成不同