蝴蝶兰组培快繁技术

蝴蝶兰组培快繁技术

蝴蝶兰是兰花科多年生附生草本植物。花朵美丽，结构精细而独特，颜色各异，花期长。它以“兰皇木兰”的声誉而闻名，具有很高的观赏价值和经济价值，市场需求量大。蝴蝶兰为单茎性气生兰,植株极少发生侧芽,常规的分株繁殖困难,而种子在自然环境中难以萌发,无法满足市场对蝴蝶兰种苗的大量需求。长期以来,科研工作者不断探索蝴蝶兰优质种苗快速繁殖的方法,并取得了瞩目的成绩。组织培养已经成为蝴蝶兰种苗繁殖最好的方法,1949年RotorG成功报道利用花梗腋芽获得试管苗到现在利用蝴蝶兰种苗的根、茎、叶等进行批量生产获得克隆种苗,满足了市场对蝴蝶兰种苗的需求。本文概述了近年来蝴蝶兰的组织培养与快繁技术的研究进展,以期为蝴蝶兰的生产发展提供参考。1苗木移栽三阶段蝴蝶兰组培的过程一般分为外植体诱导、继代增殖、壮苗、生根、健化移栽5个阶段。目前,国内外蝴蝶兰组培研究主要集中在外植体选择、基本培养基选择、植物激素种类和配比浓度、组培环境等方面。1.1外生体关于蝴蝶兰组培外植体选择方面的报道较多,且各有优缺点,主要常见外植体见表1。1.2通过培养基内诱导蝴蝶兰组培繁殖通常有无菌播种、类圆球茎(PLBs)、丛生芽三大途径。蝴蝶兰种子细小,自然条件下很少萌发,而通过无菌播种,种胚可膨大为圆球茎,后继续分化成实生苗,从而达到繁殖目的。按播种方式,无菌播种可分为裂荚播种和未裂荚播种两类,裂荚播种不容易消毒,而未裂果荚要求有足够的成熟度,多为授粉后发育4个月左右的果荚。蝴蝶兰无菌播种常用花宝一号、Kyoto和MS培养基,形成的原球体及其后小苗发育可在同一种培养基中培养;对于一些原生种的种子,在培养基中最好不添加活性炭及香蕉泥,否则原球体易白化或黄化死亡。虽然蝴蝶兰种子量大且易得,但所获得的后代植株性状不一、变异性大,商业价值低,不宜大量生产。该方法较适用于不会产生分离的品种或原生种,或应用于育种。类圆球茎是兰科植物组织培养中产生的特有现象,可以通过花梗腋芽、幼叶、根尖、茎尖等部位直接诱导,也可以先诱导愈伤组织,再从愈伤组织诱导类圆球茎。据报道,诱导类圆球茎的材料来源广泛,但不同外植体使用的培养基成分均不同。一般以叶片、茎尖诱导类圆球茎最易,根尖、根段最难。国内王怀宇等提出的丛生芽途径,是指通过诱导类圆球茎直接诱导丛生芽来稳定遗传母本特性,减少变异的方法,具有技术难度低、遗传稳定的优点。一般采用花梗中上部位的饱满腋芽作为外植体,诱导率高,每个腋芽可以诱导出1～3个芽。丛生芽途径的开辟,加速了蝴蝶兰组培苗工厂化生产的进程,成为目前蝴蝶兰无性繁殖的主要途径。在实际应用中,应根据自身条件和目的,选择合适的外植体和诱导途径。外植体虽多种多样,但消毒处理的方法类似,常选用的消毒试剂有75%的酒精、0.1%升汞、1%次氯酸钠溶液、双氧水等,消毒时间也从数秒到20min不等。2培养基和激素2.1对三大苗木枝的诱导蝴蝶兰组织培养所采用的基本培养基包括MS、B5、花宝、KC及其改良型等,其中MS基本培养基最为常用。杨美纯等研究发现,MS最适合蝴蝶兰种子萌发,王慧俞等则认为KC最适,曾宋君等研究认为花宝1号、花宝2号明显优于1/2MS、MS和KC等。鲁雪华等在花梗节间切段诱导类原球茎的试验中认为,1/2MS和改良MS比MS效果要好。廖福琴研究认为,对V31品种的幼嫩花梗诱导最佳基本培养基是MS。周俊辉等以红花品种蝴蝶兰为材料,对比MS、1/2MS和改良KC对类圆球茎的增殖效果,结果表明:改良KC效果最好,MS最差。可见,选择最适培养基应根据不同品种、不同外植体和培养阶段对组分及其浓度加以修改,最好根据培养过程中原球茎或试管苗的生长情况及时调整。2.2激素配比对植物基人原球茎增殖的影响有研究表明,单独使用生长素不能诱导出丛生芽,只有在生长素和细胞分裂素同时存在时,才能诱导出丛生芽,由此可见激素种类和浓度配比非常关键。蝴蝶兰组培中6-BA浓度为0.1～10.0mg/L,NAA使用浓度为0.05～5.00mg/L。培养基类型及激素种类和浓度会因品种和培养阶段的差异而各不相同。对于某一品种的诱导阶段和增殖阶段,所用基本培养基和激素配比可大致相同,在壮苗生根阶段则会减少激素用量甚至不添加激素。研究认为,在类原球茎的诱导阶段,添加生长素和细胞分裂素对类原球茎的诱导有利,添加细胞分裂素对原球茎的分化有促进作用。低浓度6-BA利于类原球茎增殖,而高于6.0mg/L的6-BA刺激多酚氧化酶作用,使类原球茎产生褐化。也有研究认为,1～8mg/L的6-BA能促进蝴蝶兰类原球茎增殖,而浓度为0.1～0.5mg/L的6-BA则能促进类原球茎的分化。生根诱导时只需生长素即可。何子育等则认为在增殖、生根与壮苗阶段不需加任何激素。彭立新等研究表明:在MS培养基中添加6-BA3.0mg/L+NAA0.2mg/L有利于原球茎体的诱导,激素配比为6-BA5.0mg/L+NAA0.2mg/L+活性炭1.0g/L有利于原球茎体的增殖、提高增殖系数,且不用转接就可直接生根成苗,避免转接过程带来的污染损失,简化了培养过程。曹君迈等对比了不同生长素对分枝型蝴蝶兰种胚离体培养的影响,认为NAA在1.0～1.5mg/L浓度范围内,比IBA更利于圆球茎的生长发育。除上述两类激素外,GA3在组培中也有应用:它对圆球茎分化有一定的抑制作用,可保持圆球茎的增殖能力。2.3使用高效糖代谢培养一般情况下,蔗糖作为培养基的能源物质和渗透调节剂,是首选碳源。为节约生产成本,也可以用白糖、片糖等代替,效果有时比蔗糖还好。曾宋君等认为继代培养时所需的碳源浓度比初代增殖与生根壮苗阶段高,与谢峰的研究结论相反。培养基中糖浓度过高时,会为微生物生长繁殖创造条件,因此降低糖浓度可以一定程度上降低污染率,还能够阻碍乙烯的生物合成,并提高试管苗移栽成活率,但降低糖浓度有使植株生长瘦弱、培养期延长的风险。近年来,关于代替传统糖类碳源的新型CO2无糖式光合培养模式逐渐成为研究热点。提高培养容器内CO2浓度主要采用增加容器透气性或利用一些特殊的装置将CO2直接或间接导入容器的方法。该方法要求培养材料必须含有一定的叶绿素来进行光合作用自养,前期需要一定的设备投入。2.3.2活性炭对植物的生长作用用于清除植物组织在代谢过程中产生的不利或具毒副作用的物质,亦可调节激素的供应,促进植物生长。多数研究认为活性炭具有减缓褐化和促进生根的作用。在生根培养基中加入活性炭能抑制Ca+的吸收和防止褐变,有利于根的形成和生长,获得根系较好的生根苗。周俊辉等研究表明,低浓度(0.5～1.0g/L)活性炭对原球茎增殖不明显,高浓度(2.0～3.0g/L)时能促进原球茎增殖,但出现黄化现象。需要注意的是,活性炭的吸附性是无选择性的,不仅吸附有害物质也能吸附激素,使用过程中要掌控好用量,使其既能最大程度的吸附有害物质,促进生根,又不影响植物的正常发育。另外,还需注意活性炭对培养基pH值有缓冲作用。2.3.3种常用植物的杀菌处理及对比研究为解决或防止有害微生物如细菌、真菌等侵染培养基造成污染发生,常在培养基中加入一些抑菌物质。顾伟民等曾在蝴蝶兰组培中,利用抗生素和医用杀菌剂混合得出1种应用多种植物的杀菌剂处理污染苗。抑菌物质也可对外植体进行预处理或作为消毒接种工具。崔刚等从多种植物中提取具有杀菌、抗菌活性的物质,研制出具有广谱性杀菌能力的抑生素,以此替代常规高温高压蒸汽灭菌环节,降低成本。但是抗生素各有其抑菌谱,不同外植体所适宜的抗生素种类也不一样,它们对组培苗生理生化作用及变异率的影响、怎样最大程度的降低污染率等问题,仍需要在实践中探索。2.3.4添加香蕉汁和椰子汁对原球茎生长的影响在蝴蝶兰组培中,适当加入一些有机质或天然物质,对诱导、增殖、生根都有很好的促进作用。王静等研究发现水解酪蛋白对蝴蝶兰原球茎增殖有明显促进作用,但水解酪蛋白和香蕉匀浆混合却对原球茎增殖有抑制作用。何松林等以白色花系蝴蝶兰的原球茎为材料,研究了椰子汁、马铃薯汁和香蕉汁对原球茎幼苗分化的影响,结果表明,3种添加物均可提高原球茎的增殖率,其中椰子汁和马铃薯汁的效果优于香蕉汁。王立娅依据中医理论,添加5.5g/L蝴蝶兰叶片匀浆研究其对增殖效果的影响,发现增殖效果显著好于香蕉泥、椰汁。3培训方法和条件3.1培养液体培养基的作用组织培养方式有固体培养、半固体培养和液体培养。培养基的形态对组织、细胞等外植体的生长过程、生长速度具有较大影响。通常情况下,固体培养基有利于诱导愈伤组织,而液体培养则有利于细胞和胚状体增殖。在蝴蝶兰的整个生产过程中,利用半固体培养或液体培养进行原球茎增殖,利用固体培养分化和生根,可增加繁殖系数,降低污染,减少成本,有利于大规模生产。3.2光照、培养以及微生物环境的影响在蝴蝶兰组培中,光照、温度等环境因素对培养物的生长都有很大的影响。不同光谱的LEDs对蝴蝶兰组培苗形态指标、色素含量、抗氧化酶系活性等都有影响。单色红光处理的蝴蝶兰组培苗徒长,单色蓝光处理的组培苗根系活力最高。红蓝组合和单色蓝光处理的叶片色素含量高于白光,可溶性糖、蔗糖、游离氨基酸和淀粉的含量及C/N(碳氮比)在单色蓝光下均高于单色红光处理。红光能够增加鲜重、干重,但会减少蝴蝶兰叶绿素含量,不同光谱对根长的影响差异不显著。陈菁瑛等认为在蝴蝶兰叶片培养中,500lx光照培养有利于类原球茎的形成,1000lx或者完全黑暗条件不利于类原球茎诱导。一般常见的光照强度范围为1000～2000lx。组培过程中温度过低,形成类原球茎状体所需时间较长,生长较慢;温度过高,容易造成污染且易褐变。研究表明,蝴蝶兰试管苗培养的适宜温度为25℃,也有文献指出花梗腋芽诱导时,25℃下容易出现花梗芽,28℃可以全部转换为叶芽。生产中多为26(±2)℃。偏酸性的培养基更适合蝴蝶兰生长发育,pH值多为5.0-6.5之间,在pH值5.0～5.4的环境中类原球茎生长最好,过酸或近中性的环境都不合适。经过高温灭菌后,培养基的pH值会降低,配制培养基时需注意。类原球茎增殖时切割或针刺有利于增殖而控制分化,否则类原球茎很容易分化和生根,增殖时切块应≥3mm,过小易褐化死亡。还有一些关于培养微环境如CO2、乙烯气体的研究,包括在培养过程中,这些气体的变化过程以及如何通过调节气体来改善培养效果。此外,射线辐射对生长发育也有作用,Tanaka等认为0.2T的磁场系统能显著增加类圆球茎的鲜重和干重。4植物生根壮苗蝴蝶兰增殖与诱导常使用相似的培养基,养分浓度和激素水平变化不大。对于不同品种、不同外植体来说,没有特别固定的培养基。如靖晶认为最适合蝴蝶兰丛生芽增殖培养的培养基配方是MS+6-BA5.0mg/L+NAA0.2mg/L+100g/L香蕉泥,而谭巍等则认为是改良KC+NAA0.5mg/L+6-BA7mg/L+食用糖20g/L+琼脂10g/L+活性炭2g/L。生根壮苗阶段培养基倾向不加或少加激素,壮苗与生根也可以合为一个环节同时进行,培养时间常为2个多月。林宗铿等对蝴蝶兰生根壮苗的研究发现,无机盐是影响丛生芽发根率的主要因素,蔗糖次之,NAA与多效唑影响较弱,蝴蝶兰生根壮苗最佳培养基为:花宝1号3.5g/L+NAA1mg/L+蔗糖25g/L+香蕉泥100g/L+蛋白胨2g/L+活性炭1g/L。朱红华等认为生根培养基MS+NAA1mg/L+活性炭1.5g/L最好,这可能跟试验品种或所选的基本培养基不同有关。蝴蝶兰组培瓶苗炼苗方式采用室内与室外结合3d+3d、4d+4d效果较佳。常用的移栽基质包括水苔、椰丝、草炭等单一或混合基质,以水苔效果最好。有研究利用当地常见的松针、松树皮等代替水苔作为移栽基质,也有很高的成活率。杨少辉等研究表明,蝴蝶兰适合水培移栽,大量元素配方为Ca(NO3)2·4H2O354mg/L+KNO3177mg/L+KH2PO457.5mg/L+MgSO4.7H2O185mg/L。5培养基及生长调节剂等对褐变的控制褐化是蝴蝶兰组培中最为常见的问题。有关蝴蝶兰组培褐变机理的研究多集中在褐变过程中总酚含量及苯丙氨酸解氨酶(PAL)、多酚氧化酶(PPO)和过氧化物酶(POD)活性变化上。多数研究认为,褐变与总酚含量及PAL、PPO和POD活性呈正相关。赵滢等对3个蝴蝶兰品种(B3、15、F5)总酚含量的测定结果表明,F5品种总酚含量高,但褐变程度最轻,与上述结论不一致。印芳等研究不同元素对初代培养中褐变的影响发现培养基中Fe、Cu浓度越高,褐化越严重;培养基中K、Ca、Zn随浓度升高褐变越轻。常用的控制褐化的方法为在培养基中加入抑制褐化剂及控制培养条件等。抑制褐化剂主要分两大类:活性炭、柠檬酸、聚乙烯毗咯烷酮(PVP)等吸附剂和维生素C、谷胧甘肤等抗氧化剂,生产应用较多的是活性炭和PVP。培养条件上主要有黑暗培养和热激处理。以培养基pH值6.5、培养温度20℃、培养期间光强为1000lx、预暗培养10d以及接种前对外植体双层膜遮光的减轻褐化效果较