利用根癌农杆菌遗传转化大豆的研究

利用根癌农杆菌遗传转化大豆的研究

大豆是重要的粮食、肥料和饲料。它是植物蛋白的主要来源，在国内外市场中发挥着非常重要的作用。转基因大豆的研究也因此受到普遍重视。农杆菌作为一种自然的植物基因转化系统,具有操作方便、费用低廉、可插人外源基因片段大、不易发生重排、拷贝数低且符合孟德尔遗传规律等优点,因而备受科研工作者的重视。农杆菌成功转化大豆的首例报道是由Hinchee等在1988年所作的,之后的农杆菌转化大豆方面的报道大多以Hinchee的工作为基础。Meurer等报道了农杆菌转化大豆子叶节的影响因素,发现用超声处理过的子叶节较对照容易转化,而且农杆菌菌株KYRT1的转化效果最佳。最近也相继有报道KYRT1在介导大豆转化方面可以明显提高转化效率。Olhoft等相继报道了在培养基中添加硫醇类化合物和L-半胱氨酸可以防止由农杆菌侵染而导致的组织坏死现象,从而提高转化频率,同时采用潮霉素作为筛选剂应用于农杆菌介导大豆的遗传转化,也获得了很好的效果。我们实验室以卡那霉素为筛选剂,采用EHA105建立的胚尖转化体系也获得了较高的转化频率。Paz等最近建立了一种“半种(half-seed)”系统使得大豆的转化简单化,而且转化效率有了明显的提高。从以上的报告可以看出目前农杆菌转化法采用的受体系统多数为子叶节。本研究采用大豆成熟种子胚尖作为转基因受体,采用农杆菌介导转化法获得了转基因植株,并对一些影响大豆转化效率的因素进行了探讨。在建立优化的转化体系基础上,用含有cryIA(c)和pta(Pinelliatenataagglutinin)基因的双价抗虫基因对大豆进行遗传转化。1材料和方法1.1大豆种子的处理大豆[Glycinemax(L.)Merr]成熟种子品种有合丰35,合丰39,合丰25,东农42,乐丰39,黑农37和黑农40。取表面光滑无病斑的大豆成熟种子,放入含有由30%NaClO+20%盐酸反应生成的氯气的密闭容器中,6-8h后取出放至无菌水中28℃浸泡24h。去掉种皮,将下胚轴连同刚萌动的胚尖与两片子叶剥离,去掉原叶。1.2ambi-3300本研究中用到的农杆菌菌株为琥珀碱型的KYRT1,章鱼碱型的LBA4404和农杆碱型的E-HA105。其中KYRT1菌株由美国肯塔基大学的Collins教授提供,双价抗虫载体质粒pCAMBIA3300由上海交通大学武天龙教授惠赠。农杆菌转化体系优化过程中采用的双元载体质粒为pCAMBIA3301,该质粒带有CaMV35S启动的β-葡萄糖苷酶(gus)基因(带内含子)和CaMV35S启动的除草剂抗性(bar)基因。另一个双价抗虫载体质粒为pCAMBI-A3300,该质粒带有CaMV35S启动的除草剂抗性(bar)基因,CaMV35S启动的半夏凝集素(pta)基因和Ubiquitin启动的cryIA(c)基因(图1)。参考Hofgen和Willmitzel的冻融法直接将质粒导入农杆菌菌株中。1.3乙酰丁香酮a挑取农杆菌单菌落接种于含卡那霉素100mg/L或者利福平100mg/L的5mlYEP液体培养基中,28℃摇床培养过夜,然后将菌液转至50ml新鲜的上述YEP液体培养基中摇至A600=1.4-1.6,菌体于4000rpm离心10min后重悬于感染液中[1/2MSB5(1/2MS基本培养基的无机盐浓度,附加B5培养基的有机元素),30g/L蔗糖,10g/L葡萄糖,6.0mg/LBA,0.5g/LMES,200μmol/L乙酰丁香酮,A600调整至0.5]。胚尖在预培养基(MSB5+3.5mg/LBA+0.6%琼脂)上光照培养24h后,在上述农杆菌感染液中28℃振荡培养20h,然后转至共培养基上(培养基成分同感染液,附加0.6%琼脂)暗培养5天,用无菌水洗净胚尖后转至恢复培养基上(1/2MSB5+0.2mg/LBA+0.2mg/LIBA+300mg/L头孢霉素),光照培养5-7天。恢复培养后的胚尖先后转至含有0.5、0.75和1.0mg/LPPT的筛选培养基上(1/2MSB5+0.2mg/LBA+0.2mg/LIBA+300mg/L头孢霉素),每轮培养3-4周,每10天继代一次。当抗性芽长至3cm左右时将其切下转至生根培养基(1/2MSB5+1.0mg/LIBA+250mg/L头孢霉素+0.25mg/LPPT),根长到足够健壮时敞开瓶口练苗2-3天,然后移入培养土中。幼苗长出两片新叶后,再移栽到温室中生长结实。1.4tri能力测定法按照Jefferson的方法,取共培养5d的胚尖,在筛选培养基上生长抗性胚尖,分别浸入到X-G1uc溶液(含1mmol/LX-Gluc,10mmol/LNa2EDTA,100mmol/LpH7.0的磷酸缓冲液,0.5mmol/L亚铁氰化钾,0.5mmol/L高铁氰化钾,0.1%(v/v)TritonX-100)中,37℃保温过夜。洗涤后转入75%和95%乙醇中脱色,观察染色情况。1.5pcr扩增碳质细胞系统cdk基因,克隆抗体patki取人工气候室中的抗性植株叶片,采用CTAB法提取总DNA用于检测。PCR扩增bar基因的引物为:P1:5′-GCACCATCGTCAACCACTAC-3′,P2:5′-TGAAGTCCAGCTGCCAGAAAC-3′;扩增pta基因的引物为:PXF:5′-ATGGCCTCCAAGCTCCTCCT-3′,PXR:5′-GCTTATTAATTCACCTTCTC-3′;扩增cryIA(c)基因的引物为:BTF:5′-ATGGACAA-CAACCCAAACATC-3′,BTR:5′-TAGAATCAGGAC-CCCAGACAC-3′。每个反应体积为50μL,其中含上下游引物各0.4!mol/L,4种dNTP各100!mol/L,10×buffer5μL,TaqDNA聚合酶2U,模板50ng,矿物油50μL。PCR反应参数:94℃预变性5min;然后94℃变性1min,58℃退火1min,72℃延伸1min,共35个循环;最后72℃延伸10min。5-10μLPCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳分离,观察拍照。1.6pcr扩增聚合酶pa取20-30!gCTAB法提取的高质量总DNA经HindⅢ或者SmaI完全消化后,在0.8%琼脂糖凝胶电泳上分离。参照Sambrook等的方法将DNA转至带正电荷的尼龙膜上。探针为以pCAMBIA3300为模板经PCR扩增的cryIA(c)基因片段(680bp)和pta基因片段(804bp)。采用随机引物法(Takara试剂盒)用[α-32P]dCTP进行标记。预杂交、杂交和洗膜依次按照产品说明书进行(TOYOBO杂交试剂)。杂交膜压X-光片,在-70℃放射自显影3天。2结果2.1外植体的存活率本实验中所使用的筛选标记基因是除草剂抗性基因bar,筛选剂为PPT。在转化之前,首先对各种不同的外植体的PPT筛选浓度进行确定。把经过24h预培养的胚尖和由胚尖分化的芽苗接种在含有不同浓度的PPT的芽分化培养基上。选择三种基因型进行测定,四周后统计外植体存活的数目,计算存活率,结果表明在含有PPT的培养基上,各外植体的生长明显受到了抑制,并逐渐褐化死亡。相对而言芽苗较为敏感,在PPT浓度为0.75mg/L时,它的存活率仅为2%左右。在PPT浓度为1.0mg/L时几乎所有的胚尖都死亡,而在浓度为0.5mg/L时虽然存活率为8%左右,但是存活的胚尖基本上都不能正常的产生芽苗。有研究表明在大豆子叶节系统中不同的大豆品种对选择剂的敏感性存在着一定差异,但是本试验结果显示基因型间同种外植体对PPT的敏感性没有显著差异。而且我们所采用的胚尖系统对PPT的敏感性较强,这将有利于提高转化效率以及非嵌合转化体的高效再生。在转化筛选过程中以这个PPT浓度(胚尖为0.75mg/L,芽苗为0.5mg/L)为基础进行选择。2.2eha105的gus表达大量研究表明,农杆菌对不同植物的侵染能力存在着很大差异,不同植物对农杆菌侵染的敏感性也明显不同。因此,在遗传转化研究中两者的匹配选择十分重要,即选择农杆菌与植物之间有着高侵染力的配合直接影响着转化效率。本研究中,分别属于3种不同染色体背景的农杆菌菌株KYRT1,LBA4404,EHA105被用于转化试验。将携带有同一质粒pCAMBIA3301的三个农杆菌对三种优良大豆品系的胚尖进行转化,共培养5天后进行GUS染色,计算瞬时表达率。从GUS瞬时表达结果(表1,图版Ⅰ,图A)来看:三种菌株对大豆胚尖均具有较强的侵染能力。但是相较而言KYRT1是LBA4404的转化效率的1.6倍左右,同时由于应用LBA4404为转化载体时较难操作,培养过程中易结球,共培养后较难除菌,影响了抗性苗的获得,因此首先排除LBA4404。而对于KYRT1和EHA105这两种超毒菌株而言,差别并不是很显著,但是使用KYRT1获得了最高的GUS瞬时表达频率(69.3%),另一方面进一步的研究表明KYRT1侵染后获得的抗性芽数目是EHA105的1.4倍左右。因而在随后的实验中,我们使用KYRT1作为转化用的菌株。各菌株对供试的3个大豆品种的侵染也表现出明显的基因型差异。三个受试品种对同一菌株的敏感程度依次是合丰35〉合丰25〉东农42。2.3培养条件:农杆菌生长的最共培养培养基pH对瞬时表达率的影响在不同的转化试验中有不同的结果。有研究认为较低pH对转化有利,原因是偏酸性的培养条件有利于农杆菌vir区基因的表达。也有人认为pH7.0对转化有利,原因是pH7.0有利于农杆菌生长,可缩短共培养时间,减轻农杆菌对植物材料的毒害,从而有利于转化材料生长。本实验发现,共培养基中pH为5.4时,胚尖具有最高的抗性芽得率(44.8%,图2)。当pH低于5.2或者高于5.6时抗性芽得率显著下降。2.4共培养温度和温度对农杆菌gus表达的影响共培养的温度对T-DNA的转移也有一定的影响。本实验探讨了共培养温度对农杆菌介导转化大豆的影响。大豆幼嫩的胚尖经农杆菌感染后分别在19℃,22℃,25℃,28℃四种温度下共培养5d后,检测其GUS瞬时表达及相应的抗性芽得率。结果显示(图3),22℃共培养温度条件下农杆菌具有最高的侵染活性,95%的胚尖均具有GUS活性,而且也获得了最高的产生抗性芽频率(59.8%)。当温度低于22℃时,抗性芽的数目大大下降,19℃时抗性芽得率比22℃时下降了近50%。当温度高于22℃时,抗性芽的数目也随着温度的升高而下降,28℃时的抗性芽得率与19℃时的基本一样,即最低的抗性芽得率。这说明T-DNA的转移对温度是很敏感的。2.5共培养后先进行恢复培养筛选方式对转化效率的影响较大。为确定有利于转化细胞存活和分化生长的最佳条件,我们试验了不同筛选方法对转化后大豆再生频率的影响。共培养之后外植体的生长能力较弱,如果直接转移到筛选培养基上会造成已经转化的细胞因为生长能力变弱而导致对抗生素抗性变弱而死亡。本实验中我们也采取了共培养之后先进行恢复培养的方式,这也是目前大豆遗传转化中逐渐趋向统一的一种方式。感染过的胚尖经过5-7天的恢复培养后,再进行高选择压的筛选培养,这样获得的抗性胚尖比未进行恢复培养的要多,但是抗性胚尖上刚刚萌动的分化芽大部分不能耐受高浓度的选择压力而逐渐褐化死亡。而效果更佳的筛选方式是将感染过的胚尖经恢复培养后,先进行低浓度选择压的筛选培养,再进行高选择压的筛选培养,这种方式获得的抗性胚尖及其分化频率均较高。虽然恢复培养的同时可能会造成非转化细胞的大量增殖,抑制转化细胞的增长或是造成假阳性和嵌合体,但长时间的高浓度选择压下的筛选培养,可以淘汰大量的非转化体而得到较多的转化植株。因此实验中筛选方式选用后者。2.6大豆基因型对农杆菌生长的影响我们已经研究了影响大豆遗传转化的几个因素,将这些优化的条件组合起来形成了优化的农杆菌介导的大豆遗传转化体系。大豆胚尖经农杆菌感染、共培养和恢复培养后,转移到筛选培养基上进行选择培养,抗性组织转入到分化培养基中生长并分化出芽苗(图版Ⅰ,图C,D)并具有GUS的稳定表达(图版Ⅰ,图B),当芽长至3cm左右后将其转入生根培养基中进一步发育,形成较好的根系(图版Ⅰ,图F),进而抗性小植株被移栽到温室的花盆中(图版Ⅰ,图G),最终得到假定的转基因植株(putativetransgenicplants)。用这个优化的转化体系,供试的7个大豆优良品系均得到了抗性植株,转化频率(PCR阳性植株率)为4.29%-18.0%(表2)。差不多所有的假定的转化植株形态正常并且大多数(约70%)能够正常结实(图版Ⅰ,图H)。植物基因型的依赖性是目前公认的影响农杆菌转化效率的主要限制因素。大豆基因型对农杆菌的敏感性,以及农杆菌对大豆的侵染能力直接影响到大豆的遗传转化效率,是备受关注的问题。实验结果显示不同基因型对根癌农杆菌侵染的敏感性存在着显著的差异。其中乐丰具有最高的转化率18.0%;其次合丰系列(25,35和39)和东农42也获得了较高的转化率;而黑农37和黑农43对农杆菌的敏感性最差,他们的转化效率最低。另外实验中我们发现农杆菌对取得最高转化率的乐丰39的侵染能力并没有合丰39高,但是前者的植株再生能力很强,组织培养实验中由乐丰39的胚尖产生的芽苗数目为3-5个,由健康的芽苗再生成小植株的频率达到95%,而且移栽成活率也最高。因此一个高效的组织培养再生体系对于后期的农杆菌转化至关重要。实验中我们所取得的较高的转化效率也归功于所采用的高效的胚尖再生体系。2.7转化植株叶片的分析提取PPT抗性植株的DNA,进行bar基因、pta基因和cryIA(c)基因的PCR分析。结果表明随机抽取的30个植株中有24株为阳性植株,阳性植株中三个被测基因均有表达,未出现单株差异现象。PCR阳性植株率约为80%。PCR检测结果初步证明外源基因已经整合进大豆基因组中。部分抗性植株的PCR扩增结果见图4。PCR阴性植株的产生可能是由于未被转化的芽苗在抗性培养基上的生长或者是转入的外源基因没有能够稳定地整合进大豆的基因组中。在对这些转化植株叶片进行PPT抗性分析之前,我们首先用棉棒将浓度为0、100、200、400、600mg/L的PPT溶液涂抹未转化植株叶片。1-2周后发现,当PPT浓度为200或200mg/L以上时,所有经过涂抹的大豆叶片均在一周内开始黄化,脱水萎蔫,直至枯死。因而确定200mg/L的PPT溶液为适宜用量。所有这些PCR阳性的转化植株叶片经200mg/L的PPT溶液涂抹后,均表现出对PPT的抗性(图版Ⅰ,图E)。这些结果证实了bar基因已经整合进大豆基因组并得到了表达。PCR检测bar基因、pta基因和cryIA(c)基因均为阳性的转化植株被用来进一步做Southern杂交分析。用CTAB法提取基因组DNA,用HindⅢ酶切后以PCR扩增的pta基因片段为探针进行Southern印迹分析,同时用SmaI酶切后以PCR扩增的cryIA(c)基因片段为探针进行Southern印迹分析。HindⅢ和SmaI在pCAMBIA3300质粒中虽均为双酶切位点,但是按照实验设计的程序依旧可以说明Southern杂交条带的数目基本可以显示外源基因整合位点的数目。由图5可看出,未转化植株未显示任何杂交信号,而检测的10个转化植株中有6个都显示了pta基因和cryIA(c)基因的杂交信号,证明这两个外源基因已经整合进大豆基因组中。其中有4个显示单一条带,2个显示2条带,表明外源基因在植物基因组中大多数(66.7%)为单位点整合。实验结果也证明了农杆菌转化植物外源基因拷贝数低的优点。3对农杆菌诱导的转化的作用与其他双子叶农杆菌宿主植物(如烟草、马铃薯等)比较,大豆的农杆菌介导的转化难得多,是公认的难转化植物。究其原因,我们认为大豆农杆菌介导转化的主要障碍有两个方面:一是大豆对农杆菌的敏感性差。Hinchee等从100多个基因型中只筛选到了3个转化频率较高的材料。超毒菌株EHA105在大豆转化中已被广泛使用。最近KYRT1也被证明可以有效提高转化效率。本实验中我们对三种不同染色体背景的大豆常用农杆菌菌株进行了测试,筛选得到大豆胚尖最为敏感的KYRT1菌株,有效地提高了转化效率。应试的7个大豆品种中除了黑农系列以外其他5个品系均获得了较高的转化率(12.31%-18%)。其次实验中发现胚尖再生系统可以承受更长的感染时间(20h),其原因大致如下:(1)外植体表面光滑,比较容易洗去农杆菌,而子叶节表面不光滑,褶皱较多,农杆菌不易被洗去;(2)胚尖外植体有较强的分生能力,其分生组织为原分生组织,具有很强的分生能力,感染后其生长能够抑制农杆菌的生长,从而明显降低了坏死的可能性。这样长时间的侵染也在一定程度上提高了大豆对农杆菌的敏感性。二是缺少适合于农杆菌介导转化的大豆再生体系。实验中我们采用的胚尖再生体系相对较常用的大豆子叶节再生体系具有较高的再生频率,而且单个外植体获得多芽的频率也较高。而就再生周期来看,胚尖再生体系具有更短的周期,能在较短的时间内获得更多的再生植株。因此这一高效的再生体系的使用是转化水平提高的基础。同时筛选方式的优化也有助于外源基因的整合并得到较多的