麦角固醇合成抑制剂对番茄红素生物合成的影响

麦角固醇合成抑制剂对番茄红素生物合成的影响

番茄红素是一种脂肪性调理性疾病，具有重要的自由基、抗癌、抗癌、心血管疾病、血管疾病等生理功能。目前国内外利用微生物生产类胡萝卜素和番茄红素的的微生物主要有红酵母和三孢布拉霉菌等。红酵母相比三孢布拉霉菌虽然发酵产率低,但属于饲用微生物,安全性高,发酵工艺易于调控是利用红酵母生产番茄红素的主要优点。红酵母细胞中主要的甾醇类物质为麦角固醇,具有抑制红酵母细胞色素P450介导的14α-去甲基酶(将羊毛甾醇转化为麦角固醇)的活性。麦角固醇缺乏、羊毛甾醇和其他14α甲基固醇的堆积,使真菌细胞膜的通透性、膜结合酶活性(如内源性呼吸)和角质素合成异常,从而提供更多的法尼基双磷酸酯(FPP)用于红酵母细胞中另一聚异戊二烯类物质——类胡萝卜素的合成,使得类胡萝卜素生物合成量增加。类胡萝卜素合成过程中,番茄红素转变为β-胡萝卜素的关键酶是β环化酶,抑制番茄红素环化可以积累大量的番茄红素。本文主要研究了不同麦角固醇生物合成抑制剂在红酵母RY-17发酵生产番茄红素过程中的应用,同时研究了该抑制剂与β环化酶同时添加对发酵的影响。1材料和方法1.1蘑菇红酵母RY-17,中国药科大学生化教研室保存。1.2主要设备和试剂1.2.1氟康唑注射液N-甲基吗啉、十二环吗啉,分析纯,国药集团化学试剂有限公司;嗪氨灵,分析纯,昆山泰达化学有限公司;氟康唑注射液,江苏淮安双鹤药业有限责任公司;酮康唑片剂,西安杨森制药有限公司;番茄红素对照品,Sigma公司。酮康唑水溶液的制备:取酮康唑片剂0.5g,加入水定容至5ml,溶解过滤灭菌后待用。1.2.2型离心沉淀机隔热式电热恒温培养箱,上海跃进医疗器械厂;LXJ-2型离心沉淀机,上海医用分析仪器厂;SW-CJ-IF超净工作台,苏净集团;721分光光度计,上海第三分析仪器厂;SPD-10A型高效液相色谱仪,岛津公司。1.3培养基%斜面培养基(%):葡萄糖2,蛋白胨2,酵母膏1,琼脂2,自然pH值。摇瓶种子培养基(%):葡萄糖2,蛋白胨1,酵母膏1,自然pH值,装液量40ml/250ml瓶。摇瓶发酵培养基(%):葡萄糖4,蛋白胨1,酵母膏1,自然pH值,装液量80ml/500ml瓶;将菌种26℃活化48h后,接至摇瓶种子培养基中,在26℃振荡培养约28h,然后按10%接种量接入摇瓶中,在26℃,220r/min振荡培养72h。1.4生物量的测量取发酵液50ml,在4000r/min离心20min,称重。1.5色素提取液的制备采用酸热法破壁提取,取发酵液5ml,加入1.5ml盐酸(10mol/L),室温振荡浸泡1h,沸水浴5min,冰浴,以4000r/min离心20min,洗涤1次,加入乙酸乙酯5ml,室温下振荡提取30min,4000r/min离心20min,上清液即为色素提取液。1.6标准曲线的制备将色素提取液用0.2μm的微孔滤膜过滤后,以高效液相色谱法(HPLC)测定提取液中番茄红素的含量。同时配制不同浓度的标准品溶液,在相同条件下测定,根据峰面积制备标准曲线定量。高效液相色谱条件:流动相为乙腈∶二氯甲烷=21∶4;检测波长为472nm;体积流量1.0ml/min;进样量为20μl。2结果2.1麦角固醇对胡萝卜素生物合成的影响在红酵母发酵生产番茄红素过程中加入麦角固醇合成抑制剂,考察麦角固醇合成抑制剂对番茄红素代谢过程的作用。结果如图1所示。由图1可知,和Ⅰ比较,Ⅱ加入麦角固醇合成抑制剂后,可以使β胡萝卜素生物合成量明显增加;从Ⅲ可以看出加入β-环化酶抑制剂,番茄红素的进一步代谢为β-胡萝卜素的过程被抑制;同时添加麦角固醇合成抑制剂和β-环化酶抑制剂可以使番茄红素得到积累,产量提高。2.2麦角固醇合成酶抑制剂对类胡萝卜素合成的影响在发酵的不同时间加入酮康唑溶液5ml/L,总发酵时间72h,菌体的类胡萝卜素生物合成量与酮康唑加入时间的关系如图2所示:从图2可见,随着酮康唑加入时间的延长,菌体干重呈现上升的趋势,类胡萝卜素合成量呈现先上升后下降的趋势,在24h处有一个较大的上升。发酵早期添加麦角固醇合成酶抑制剂会抑制菌体的生长,菌体生物量明显下降,影响类胡萝卜素的合成;在发酵后期添加,无法提供更多的FPP用于类胡萝卜素的合成。实验表明抑制剂最佳加入时间为24h左右。2.3不同剂量对红酵母生长和番茄红素合成的影响在发酵24h时加入不同剂量的麦角固醇抑制剂,总发酵时间72h,考察不同剂量的十二环吗啉(Dodemorph),嗪氨灵(Triforine),酮康唑(Ketoconazole),氟康唑氟康唑(Fluconazole)对红酵母生长以及番茄红素合成的影响,结果如图3所示:从图3中可以看出十二环吗啉和嗪氨灵对红酵母生长有明显的抑制作用,随着抑制剂添加量的增加,菌体量下降,类胡萝卜素的合成量呈先增加后略微减少的趋势,减少是因为发酵生物量减少;随着酮康唑的添加菌体和类胡萝卜素都呈现先上升后下降的趋势;氟康唑对菌体生长的抑制作用不明显,类胡萝卜素的含量呈现增长的趋势。本实验十二环吗啉,嗪氨灵,酮康唑,氟康唑的最适加入量分别为1.0g/L,2.0ml/L,7.5ml/L和75ml/L,此时类胡萝卜素产量分别为29.32mg/L,35.76mg/L,47.63mg/L,40.21mg/L。实验结果表明酮康唑和氟康唑促进类胡萝卜素积累效果要优于十二环吗啉和嗪氨灵。其中酮康唑在发酵24h添加最多可使红酵母总色素产量提高173%。2.4n-甲基吗啉对发酵的影响在发酵24h加入5ml/L的酮康唑溶液,在发酵28h加入不同浓度的β-环化酶抑制剂N-甲基吗啉,总发酵72h,考察不同浓度的N-甲基吗啉对发酵的影响,结果如图4所示:从图4可见添加β-环化酶抑制剂可抑制番茄红素转变为β胡萝卜素,随着N-甲基吗啉添加量的增加菌体重量呈现下降的趋势,在10ml/L时抑制菌体生长不利于色素合成;番茄红素产量呈现先上升后下降的趋势。实验表明N-甲基吗啉的最好加入量为7.5～8.75ml/L之间,此时番茄红素产量为24.23mg/L。3环化酶抑制剂红酵母生物合成及活性成分变化(1)添加麦角固醇合成抑制剂后,麦角固醇合成量被抑制,红酵母合成类胡萝卜素量明显增加,说明加入适当的麦角固醇合成抑制剂可改变红酵母代谢途径。酮康唑和氟康唑要明显优于十二环吗啉和嗪氨灵。(2)未添加环化酶抑制剂时红酵母代谢生成的主要是番茄红素环化后产物(β-胡萝卜素及γ-胡萝卜素),添加该酶抑制剂N-甲基吗啉后产物中环化产物所占的比例大幅度减少,番茄红素大量蓄积,说明加入适当的环化酶可改变番茄红素代谢途径,提高其生物合成量。(3)红酵母中甾醇类物质和类胡萝卜素的生物合成是通过生物体内