大鼠左前降支模型的建立

大鼠左前降支模型的建立

近年来，心血管疾病已成为老年人常见的疾病，传统临床治疗效果较差。本研究所将动物模型的制作方法-冠状动脉前降支结扎法大鼠心肌梗死模型制作法报告如下。1模型的建立与观察1·1实验动物清洁级Wistar近交系大鼠85只(购自中国科学院上海实验动物中心),均为雄性,体重280～300(291.3±5.2)g克,饲养环境为清洁级。所有动物随机分成假手术组(n=6)和模型组(n=79)。1·2主要仪器与试剂心电图机(NihoKohden),DH150型动物呼吸机(浙江医科大学医疗仪器设备厂),Langendorff系统(Radloti公司),Buxco系统(Buxco公司),戊巴比妥钠(上海试剂二厂)等等。1·3实验方法1·3·1动物模型的建立模型组大鼠0.6%戊巴比妥钠(30mg/kg)腹腔内麻醉,气管插管,接空气呼吸机,呼吸频率90次/min,潮气量8～10ml,吸呼比1∶1。左前外侧切口经第三肋间进胸。大部分动物在左心耳下缘与肺动脉圆锥间可以看见左冠状静脉主干走行,LAD与之伴行。用6-0prolene线在距左心耳下缘约1～2mm处,左冠状静脉主干附近的室间沟内,将LAD连同少量心肌组织一起缝扎。发生室颤者予腹腔内注射1%利多卡因1mg/kg,大多自动复律。逐层关胸,颈部切口开放,一般术后2d自愈。手术在严格无菌条件下进行。分别于结扎前,结扎后5min,30min,2周记录心电图。大鼠术后每只肌注青霉素钾10万U/d,连续3d。假手术组仅缝线而不打结,其余同模型组。1·3·2组织学检测假手术组中随机抽取2只大鼠于手术后4周处死。模型组中随机抽取6只大鼠,分别于建模后1小时,2周,4周处死(每时段各2只)。取左心室组织制成石蜡切片,HE染色后,光学显微镜下观察。1·3·3心功能检测建模后4周,模型组随机抽取6只大鼠和假手术组存活的6只大鼠用非循环式langendorff系统检测心功能。全麻,肝素化后,迅速摘取心脏,置于4℃K-H液中,修剪后将其挂在灌注管上,切开左心耳,经二尖瓣口置入一个乳胶球囊,另一端接压力换能器,由Buxco系统监测血流动力学指标。左室舒张末压维持在10mmHg以内,灌注压维持在100cmH2O。K-H液先经95%O2+5%CO2饱和1h,灌注过程中用95%O2+5%CO2持续平衡,37℃恒温。稳定灌注30min后,记录LVSP、LVDP、±dp/dtmax、HR。1·4统计学处理数据以x¯±sx¯±s表示,采用SPSS11.5软件进行分析。2组间比较采用成组t检验,P<0.05认为差异有统计学意义。2大鼠心电图改变2·1大鼠存活情况假手术组6只大鼠,术后全部存活。建模组79只大鼠,术后共死亡13只。其中早期(手术后24h内)死亡10只:急性右心衰1例;顽固性室颤2例;急性左心衰3例;窒息2例;麻醉意外1例;呼吸衰竭1例。晚期死亡3例:慢性心衰2例;严重感染1例。2·2心电图变化假手术组心电图仅在过线后1h内有一过性ST-T改变,无病理性Q波出现。模型组心电图在结扎LAD后马上出现ST段弓背向上抬高,继而与高尖T波相连形成旗帜样改变,结扎后2周可见病理性Q波(图1)。模型组中有2只大鼠心电图改变不明显,解剖后发现左室游离壁未见明显变薄,变白区域,证实为建模失败。余者均出现病理性Q波,其中58只出现在胸前导联(仅出现在胸前导联的53只;伴Ⅰ,aVL导联的3只,伴Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,aVL,aVF导联的2只),6只出现在Ⅰ,aVL导联。2·3形态学比较建模4周后模型组大鼠心脏标本活体肉眼观,左室前外侧壁可见椭圆形、不规则形心肌变白区,变白区心肌活动度减弱或消失,甚至有反常运动,形成室壁瘤(图2-A)。左室横切面观,心梗组左室游离壁明显苍白,变薄,室间隔无明显改变(图2-B)。而假手术组大鼠心脏标本左室横切面显示心肌组织颜色红润,心室壁各处厚薄均匀,无心肌组织变薄或颜色变化(图2-C)。2·4病理学检测假手术组大鼠组织切片HE染色显示心肌纤维排列规则,无炎性细胞浸润,无纤维疤痕组织增生(图3-A)。心肌梗死后1h,心肌组织开始水肿,大量炎性细胞浸润(图3-B)。心肌梗死后2周,可见炎症反应较前减轻,心肌纤维排列紊乱,有的甚至发生断裂,纤维组织开始增生(图3-C)。心肌梗死后4周,左心室游离壁心肌组织大量坏死,由纤维疤痕组织所取代,存活的少量心肌组织被分隔成岛状,散在分布(图3-D)。2·5心功能检测LVSP、LVDP、±dp/dtmax均表现为模型组显著低于假手术组(P<0.01),HR2组间差异有统计学意义(P<0.05)见表1。3大鼠心肌梗死稳定性分析3·1建模方法的选择心肌梗死动物模型根据制作方法不同主要分为两类:⑴通过转基因或基因敲除等方法造成严重的高脂血症及动脉粥样硬化,继而引起心肌梗死。优点在于接近人类发病的过程,但费用高,需时长,梗死部位变异性大。⑵人工阻塞左冠状动脉,使动物造成急性或慢性心肌缺血及梗死;包括冠状动脉结扎或夹闭术及冠状动脉阻塞术。特点是周期短,虽无血脂变化,却非常接近缺血引起的心肌坏死病理过程。本实验采用的就是后一种方法。3·2模型存活率分析如何降低动物的死亡率并保持模型的稳定性是建造动物模型的关键。本实验模型组79只大鼠中死亡13只,存活66只,总体存活率为83.5%,高于国内其它同类型研究。提高模型动物的存活率几个方法:⑴低剂量、低浓度麻醉。降低给药浓度,可以相对提高给药的安全范围,利于苏醒。张润峰等发现,动物麻醉后的苏醒时间显著影响建造心肌梗死动物模型的成功率。⑵术中操作规范动作轻柔,避免副损伤。进胸后,可用纱布将肺组织与心脏隔开,拉钩也可用纱布缠绕,以减少肺组织与坚硬物体的接触。结扎时要快、准,打结时不宜过度牵拉;否则,易切割心肌组织,造成严重的心肌损伤。如果心脏出血,切忌盲目钳夹,可用干纱布压迫出血点,大多数情况下可以止血。⑶术中应严格无菌操作、术后坚持抗感染。⑷术中、术后注意清理呼吸道。大鼠苏醒后,立即将其改为俯卧位,也有利于排痰。3·3模型稳定性分析如何保持心肌梗死模型稳定性关键在于在同一位置确切结扎LAD,这也是降低大鼠死亡率的关键。从心脏表面观察,由于大部分动物的LAD表面覆盖有一薄层心肌组织,肉眼很难辨认。而与之伴行的左冠状静脉主干位置变异度小,且表浅,易于肉眼观察(大多数动物在左心耳与肺动脉圆锥之间均可见其走形),是非常有用的定位指标。根据左冠状静脉定位后,在左心耳前下方1～2mm处进针,深度1～2mm,跨越前室间沟出针,打结,基