番荔枝根腐病的发生与防治

番荔枝根腐病的发生与防治

又名半荔枝、释迦牟尼果、林芙。是世界5大名果之一,属番荔枝科(Annonaceae)。番荔枝已报道病害有50多种。其中,根腐病是番荔枝的重要病害,是制约番荔枝产业发展的主要因素之一。受侵染植株根部的皮层及木质部变黑腐烂,有些病根表面长有菌索;地上部分叶片逐渐变黄,最后整株枯死(图1-3)。在广东湛江市郊的南亚热带作物研究所(南亚所,下同)的番荔枝园,每年均有30%左右因根腐病而枯死,2004年发病率高达36.8%。此病一般在种植后3年后开始出现,若有台风影响时感病更重。对番荔枝根腐病病原菌的鉴定已早有报道,但各地的报道不一。戚佩坤等从番荔枝幼苗病根中分离到CylindrocladiellatenuisZhangC.F.etP.K.Chi.为根腐病的致病菌。而莫晓凤等从进境的番荔枝幼苗中分离到了番荔枝根腐病病原菌潮湿镰刀菌FusariumudumButler。高爱平等报道,番荔枝幼苗根腐病由Pseudomonassolanacearum引起,受其侵染后根颈腐烂,根木质部组织变黑,树体衰弱致死,在海南粘重板结的砖红壤中,由此病原菌引起的根腐病发病率可达30%。Hayward也报道了P.solanacearum引起番荔枝幼苗根腐病。Fitzel等从番荔枝成龄树中分离到了Pythiumsp.和Phytophthorasp.,此2种病菌均可引起番荔枝根腐及树体衰退。在根腐病的防治方面,有效的防治措施报道较少。随着无公害农业或绿色食品生产的发展,利用拮抗微生物进行生物防治是一种很好的策略。将培养好的拮抗微生物施入土壤中,并在土壤中繁殖,可降低土壤中病原菌的密度,并对病原菌有抑制作用,减轻病害的程度。如Fang等用强壮青霉(Penicilliumfuniculosum)防治柑橘疫霉根腐病。Sswant等用哈茨木霉(Trichodermaharziamum)、绿木霉(T.viricde)和绿色粘帚霉(Gliocladiumvirens)防治由寄生疫霉(P.parasitica)和芋疫霉(P.colocasiae)引起的柑橘根腐病,可以减少吸收根的腐烂,增加树体的生长量。综上所述,番荔枝根腐病病原菌的鉴定已有不少报道,而发病率较高的南亚所果园的病原菌尚不清楚。因此,本研究对南亚所的番荔枝根腐病病原菌进行了初步鉴定,然后筛选对其病原菌有拮抗活性的生防真菌,为番荔枝根腐病的无公害防治打下基础。1材料和方法1.1保定市试剂、抗病性分离番荔枝病根采集自广东湛江市郊的南亚所番荔枝种植园,均为成龄结果树的病根。1.2培养基的选择V-8选择性培养基Ⅰ和Ⅱ的配制,分别用于对疫霉菌和腐霉菌的分离:V-8汁340mL,加CaCO35g稍加热溶解,离心(4000r/min,20min),取上清液,加蒸馏水定容至3000mL,分装到15个250mL的三角瓶,每个瓶装200mL,每瓶加入琼脂4g,高压灭菌。选择成分Ⅰ:Benomyl80μLg/mL,Rifampicin100μg/mL,Nystatin50μg/mL,Hymexazol80μg/mL,Ampicillin100μg/mL;选择成分Ⅱ:Benomyl80μg/mL,Rifampicin100μg/mL,Nystatin50μg/mL,Ampicillinl00μg/mL。加入选择成分Ⅰ时为“V-8选择性培养基Ⅰ”,加入选择成分Ⅱ时为“V-8选择性培养基Ⅱ”。PA培养基:马铃薯琼脂培养基,不加入葡萄糖,用于其他真菌的分离。PDA培养基:常规的PDA培养基,用于保存菌种。1.3人才培养方向切取表现典型根腐病的病根病健交界处的组织,切成5mm×5mm小块。然后把这些小块分成3部分,第1部分直接置于V-8选择性培养基Ⅰ上培养;第2部分直接置于V-8选择性培养基Ⅱ上培养;第3部分则先用75%酒精消毒1min,再用0.1%的HgCl2消毒1min,后用灭菌水洗5次,置于PA培养基上培养。对每个分离物分别进行纯化培养,并保存于试管斜面上备用。1.4用分生孢子悬浮液接种取普通番荔枝(A.squamosa)种子播种,盆栽小苗,土壤事先灭菌,每盆取10株高度粗度一致的小苗做致病性测定。取疫霉菌菌丝块置于灭菌水中,28℃下培养1-2d,待长出孢子囊后放入4℃冰箱中5min,让其释放游动孢子,制作游动孢子悬浮液,淋于小苗根部。腐霉菌以菌丝接种,其它真菌均用分生孢子悬浮液(约106个/mL)接种。接种后保湿48h,观察发病情况,后期进行再分离。每处理一盆10株,重复3次,对照用无菌水。18d后调查发病率。1.5形态鉴定方法对有致病力的菌株分别进行鉴定。疫霉菌鉴定:从V-8培养基平板上观察菌落形态,挑取菌丝于显微镜下,观察菌丝的分枝和膨大情况,测定菌丝直径;将V-8平板上长好的分离菌切取小方块移于无菌水中培养1-2d,挑取菌落于显微镜下观察孢子囊形态、孢囊梗分枝形式,测量80-100个孢子囊大小、孢子囊柄的长度,观察乳突特征等。根据以上对分离菌各项形态特征的描述,参照魏景超的《真菌鉴定手册》,HoHH等的《ThegenusPhytophthorainTaiwan》等资料进行鉴定。其它真菌类的鉴定参照魏景超的《真菌鉴定手册》分别进行鉴定。1.6回复加强、稳定性培养在南亚所番荔枝果园中,采集健康植株土表以下5-10cm的根系周围土壤、叶片和果实。取土10g,加灭菌水50mL于灭菌的三角瓶中充分振荡混匀,1000r/min常温离心10min,取上清液1mL,加入灭菌水9mL稀释。在稀释液中再取1mL,同样加入灭菌水9mL稀释,如此重复4-6次。最后取50μL均匀涂于PDA平板上,置26℃下培养。待平板中出现有单菌落时,挑取菌落移入试管斜面中培养。另取干净的番荔枝健康叶片、果皮各10g,置于研钵中研磨,充分研碎后与50mL灭菌水混合在三角瓶中充分振荡混匀,用上述一样的方法进行培养和保存菌株。然后对各保存菌株进行活化并与各病原菌进行对峙培养,测定抑菌半径。1.7抗生细菌的鉴定对有较强拮抗活性的生防菌株进行鉴定,方法参照1.5所述。1.8番有力苗的培养取普通番荔枝种子经表面消毒后在经灭过菌的土壤中进行盆播,小苗长出后,分别以各拮抗菌振荡培养7d的菌液浇入番荔枝小苗的根茎部位,另外,以25%瑞毒霉(Metalaxyl)可湿性粉剂600倍液作为参照,对照为无菌水,25-28℃培养10d。然后以番荔枝根腐病各病原菌的孢子悬浮液或游动孢子悬浮液在番荔枝的根部进行擦伤接种,每处理3次重复,每重复10株小苗,10d后计算发病率。2结果和分析2.1细菌的分离从番荔枝根中分离到5种不同的真菌,分述如下。2.1.2孢囊梗分生长在V-8培养基上菌落圆形、灰白色,气生菌丝无隔、较不丰富;菌丝体水培后形成较多的淡褐色厚垣孢子;孢囊梗一般呈简单合轴分枝;孢子囊形状不规则,呈椭圆形、卵圆形或不对称的弯月形,大小38-70μm×21-47μm,乳突明显。2.1.3刀菌fisariumsp.在PDA培养基上菌落分散、近圆形,菌丝无隔,气生菌丝丰富、绒毛状;孢子囊球形或椭圆形,顶生或间生,直接或简接萌发。2.1.4镰刀菌(Fusariumsp.)在PDA培养基上菌落近圆形;菌丝纤细、有隔,气生菌丝丰富;有小型和大型分生孢子,小型分生孢子卵形、椭圆形或圆筒形,大型分生孢子纺锤形或镰形,两端尖。2.1.5培养基表面微菌核在PDA培养基上菌落不规则、灰褐色;菌丝有隔、褐色,近直角分枝,并多数在分枝近处形成隔膜;菌核褐色,平均如米粒大小,形状无规则,微菌核常在培养基表面相互连成壳状;不产生无性孢子。2.2致病菌力测定接种结果表明,寄生疫霉、镰刀菌的致病力较强,棕榈疫霉的致病力较弱。腐霉菌、立枯丝核菌的致病力均很低,并且后期没有分离到原菌株(表1)。由此可知,寄生疫霉、镰刀菌和棕榈疫霉均有可能为番荔枝根腐病的病原菌。2.3培养基上菌落的生长对平板上的单菌落逐一进行对峙培养,最后获得7个抑菌带较宽的分离物。通过复筛,其中有3个菌株对根腐病病原菌均有较强的抑制作用,初步鉴定为木霉菌(Trichodermasp.),分别记为T19、T90和T92。其主要形态特征:在培养7d的PDA培养基上菌落圆形,边缘形成浅绿色毡状的气生菌丝,菌落反面黄绿色;分生孢子开始为白色,后来转变为绿色;分生孢子梗有粗直的主轴,初级分枝间距规则,有二级分枝,二级分枝可再次连续分枝;产孢细胞瓶形,通常在分生孢子梗的顶端呈二歧式轮状排列,较少单生;分生孢子单细胞,无色、浅灰色或绿色。2.4对3个抗菌株的生防能力各拮抗菌对各病原菌的拮抗测定见表2,抑菌带宽度在9-26mm,除T19对Fuariumsp.和T90对Fusariumsp.、P.parasitica的抑制效果较差外,其它均在15mm以上,由此可见,筛选到的3个拮抗菌株均有良好的生防潜能。2.5瑞毒霉属和受毒霉的比例表3表明,每种拮抗菌对各病原菌均有显著的防效,并且大部分优于瑞毒霉。表明了每种拮抗菌对3种病原菌均有一定的抑制作用,而且,这3种病原菌分属于卵菌和半知菌,表明筛选到的拮抗菌的抑菌谱可能较广。3讨论3.1主要病原菌的确定本研究证实了P.parasitica、P.palmivora和Fusariumsp.是引起南亚所番荔枝根腐病的主要病原菌,同时也说明了本研究的样本采集地的番荔枝根腐病是几种病原菌复合侵染的结果,但初次侵染菌的确定有待于进一步的研究。另外,分离到的Fusariumsp.具体种名也有待于进一步鉴定。3.2番有力的病虫草害防治根腐病是番荔枝严重的病害,尤其是普通番荔枝或以普通番荔枝为砧木的植株感病较重(内部资料)。此病害一旦发生,一般经过3-4年后整个果园植株陆续死亡。本研究采用对峙培养法,从番荔枝的根际土壤、叶片和果实中分离到了3个有较强拮抗活性的生防菌株,为开辟番荔枝根腐病的生物防治提供重要的原材料,为番荔枝的无公害生产打下基础。番荔枝在我国台湾、广东、福建、海南和云南等地均有种植,番荔枝根腐病在各地均有不同程度的发生,有的给番荔枝的生产带来严重的影响,因此对番荔枝根腐病的防治研究在番荔枝生产中起着重要的作用。本研究对南亚所的番荔枝根腐病作了初步鉴定,并对其生物防治进行了初步的探索,具有