一株多粘类芽孢杆菌对番茄幼苗生长的促生效果

一株多粘类芽孢杆菌对番茄幼苗生长的促生效果

多酚类半体生长菌是一种广泛属于主体的根际促生菌，对由真菌、细菌和线虫引起的植物疾病有预防作用。Timmusk等研究发现多粘类芽孢杆菌处理后,可在植物根际大量定殖,有效拮抗棕榈疫霉Phytophthorapalmivora和瓜果腐霉Pythiumaphanidermatum。Khan等报道P.polymyxaGBR-1能抑制根结线虫卵孵化和毒杀幼虫,可有效减少番茄根结形成。Mageshwaran等报道P.polymyxaHKA-15的代谢产物可以有效拮抗植物病原细菌Xanthomonascampestrispv.phaseoli。Ryu等报道在田间试验中芝麻种子经P.polymyxaE681包衣处理后,可以显著控制猝倒病,解决了芝麻连作的难题。多粘类芽孢杆菌可产生多种抗生素、多粘菌素及各种水解酶等拮抗物质,这些拮抗物质是多粘类芽孢杆菌发挥生物防治作用的重要机制之一。除此之外,多粘类芽孢杆菌能够诱导植物产生水杨酸,从而引发诱导性系统抗性(ISR)。多粘类芽孢杆菌还可以合成植物生长素、细胞分裂素、胞外多糖,增强土壤通透性,具有溶磷、固氮的活性[11~13]。多粘类芽孢杆菌可定殖于植物的根际及土壤,为生防功能的表现奠定了基础。本研究从浙江天目山柳杉中分离获得了1株细菌CF05,通过菌株形态特征、16SrDNA序列分析及其生理生化反应,确定菌株CF05为1株多粘类芽孢杆菌,平板测定表现出对植物病原真菌和细菌明显的拮抗特征。本研究从离体拮抗、种子萌发、防病、促生、根际定殖稳定性等方面,初步测定了该细菌的促生及生防效果,探讨了其作为生防促生细菌的应用潜力。1材料和方法1.1枯病菌种cr种植多粘类芽孢杆菌P.polymyxaCF05,P.polymyxaATCC842T,枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis168病原真菌水稻稻瘟病菌Magnaportheoryzae,水稻纹枯病菌Rhizoctoniasolani,小麦纹枯病菌Rhizoctoniacerealis,番茄灰霉菌Botrytiscinerea,番茄早疫病菌Alternariasolani,棉花枯萎病菌Fusariumoxysporumf.sp.vasinfectum,瓜果腐霉P.aphanidermatum,西瓜枯萎病菌F.oxysporumf.sp.niveum,百合根腐病菌F.oxysporumf.sp.lilii,病原细菌水稻白叶枯菌X.campestrispv.oryzae,白菜软腐病菌Dickeyadadantii,葡萄根癌菌Agrobacteriumvitis,均为本实验室保存。1.2细菌形态特征牛肉膏蛋白胨固体培养基(nutritionagar,NA)培养细菌16h,戊二醛固定后,扫描电子显微镜(HitachiTM-1000,KYKY-EM3200)观察细菌形态特征。1.31细菌16srdna序列及测序采用CTAB法提取菌株CF05的基因组DNA。通用引物(8F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′,1513R:5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′)扩增细菌的16SrDNA序列。扩增产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳纯化,进行测序。利用DNAMAN和MEGA5.1软件构建系统进化树。1.4生理生化反应生理生化特征鉴定参照文献和方法进行。1.5抗病菌抗氧化活性测定马铃薯葡萄糖琼脂(potatodextroseagar,PDA)平板中接入直径约6mm的新鲜病原真菌菌丝饼,距菌丝饼约2.5cm处接种待测菌株,以枯草芽孢杆菌B.subtilis168菌株为对照,25℃培养,测量拮抗圈直径。每个处理3个重复。采用Stonier双层法测定其拮抗病原细菌效果。菌株CF05作为下层产素层,上层为病原细菌,以B.subtilis168为对照。每个处理3个重复。1.6从cf06菌体制备cf2005菌悬液菌株CF05发酵液和菌悬液的制备:挑取菌株CF05单菌落接种于PDB(PDA中不加琼脂)培养基中,28℃、160r/min培养24h,取100μL培养液转接于100mL的PDB培养基中,28℃、160r/min培养80h。所得培养液10000r/min离心10min。离心所得上清液用细菌过滤器(Millipore,0.22μm)过滤后即为发酵液;离心所得菌体用无菌水清洗5次,然后再用无菌水重悬并调浓度至107CFU/mL,即为菌株CF05菌悬液。番茄种子(浙粉202,浙江浙农种业有限公司)用75%乙醇表面消毒30s,无菌水漂洗3次。30℃温水浸种4~5h,种子于28℃催芽。种子发芽后,播种于穴盘(32孔,6cm×4.5cm)中,每穴2~3粒种子,覆盖1cm厚基质(蛭石:珍珠岩:泥炭:土壤体积比为1:1:1:1)。待幼苗长出2片以上叶子后,开始浇灌发酵液和菌悬液,每次每穴浇灌10mL。发酵液处理分为4个浓度梯度,将原发酵液分别稀释1、10、20、50倍,对照为无菌水;菌悬液处理分为3个浓度梯度,分别为107、106和105CFU/mL,对照为无菌水。每个浓度5个重复,生长3周后测量幼苗鲜重及干重。1.7抗性菌株cf2005的催芽、出苗平板筛选菌株CF05抗利福平的突变体,获得能在含20µg/mL的利福平培养基上生长的抗性突变体。制备抗性菌株CF05菌悬液(方法同原始菌株CF05),菌悬液浓度分别为108、107、106和105CFU/mL。经表面消毒的番茄种子浸入抗性菌株CF05不同浓度的菌悬液中,25℃、80r/min振荡培养2~3h后,将种子置于28℃催芽,期间喷洒相应处理浓度的抗性菌株CF05菌悬液保持种子湿润。2~3d种子发芽,将其种入穴盘(培养基质配方同1.6并经灭菌处理)中。待番茄出苗后2、7、12、17、22、27d取土样(整个根系以及紧密黏着的土壤),每个处理3个重复。将1g土样浸泡在9mL的磷酸缓冲液(50mmol/L)中,置于转速为150r/min摇床振荡30min。梯度稀释所得含菌缓冲液,涂布于含20µg/mL利福平的LB培养基上,每个梯度3个重复。平板于28℃静置培养2d后进行菌落计数。根际定殖细菌量以logCFU/g根计数。1.8种子萌发率测定制备浓度为108CFU/mL的菌株CF05、168菌液,多菌灵4000倍液(四川国光农化股份有限公司,50%可湿性粉剂)。灭菌培养皿中分别放入10mL的菌株CF05、168菌液及多菌灵溶液,以无菌水为对照,每个处理3个重复。每皿放入1g经表面消毒的番茄种子,处理12h。种子置于28℃催芽,计算萌发率。PDB培养基培养番茄猝倒病病原菌P.aphanidermatum,制备菌丝悬浮液。菌丝悬浮液与无菌基质按照1:10(V/W)均匀混合,制成感病基质,分装入营养钵(26cm×21cm)中。将上述所得萌芽种子种入营养钵中,每处理3个重复,每个重复25粒萌芽种子,播种25d后计算发病率。1.9数据的统计与分析试验数据利用DPSv7.05数据系统进行统计分析,显著性水平采用Duncan’s新复极差法分析。2结果与分析2.1菌株的生理生化特性菌株CF05在NA培养基上形成乳白色菌落,半透明,菌落光滑,挑起有黏性。扫描电镜显示,菌体为棒状,单个,0.7µm×4.2µm(图1A),产生近球形芽孢(图1B)。PCR扩增获得菌株CF0516SrDNA部分序列(JX997944)。DNAMAN和MEGA5.1软件系统发育分析结果显示,该菌株的遗传进化与多粘类芽孢杆菌最近,构成一个分支(图2)。生理生化反应特征(表1)显示,菌株CF05的耐盐性为2%,在5%含盐培养基上不能生长。在糖发酵反应中,可以利用D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、甘露醇、甘油、乳糖、蔗糖等多种碳源。厌氧生长、接触酶、硝酸还原反应、水解淀粉、V-P反应、水解酪蛋白反应等均为阳性,而柠檬酸钠利用、琥珀酸钠利用、H2S产生、氧化酶等反应为阴性。菌株CF05与B.subtilis168在耐盐性、氧化酶等方面的反应特点有所不同,与文献报道的标准菌株P.polymyxaATCC842T的反应特点相同。结合16SrDNA序列分析和生理生化特征,将菌株CF05鉴定为多粘类芽孢杆菌P.polymyxa。2.2对真菌的诱导诱导菌株CF05对供试病原真菌、细菌均具有较好拮抗效果。其中在真菌拮抗中,对番茄灰霉菌拮抗效果最好,拮抗圈直径达到3.13cm,其次是水稻稻瘟病菌,番茄早疫病菌,棉花枯萎病菌,水稻纹枯病菌,小麦纹枯病菌,所有拮抗真菌效果均优于B.subtilis168。在细菌拮抗中,菌株CF05对水稻白叶枯菌拮抗作用最明显,拮抗圈直径为4.51cm,其次是白菜软腐病菌,拮抗病原细菌效果也均优于B.subtilis168(表2)。2.3发酵液、干重、菌悬液的制备温室条件下测定了菌株CF05不同浓度发酵液(图3A)和菌悬液(图3B)的促生效果。发酵液对番茄幼苗促生效果明显,鲜重和干重均有较大增量。发酵液稀释倍数为1、10、20、50倍时,与对照相比鲜重分别提高为272.0%、199.3%、142.7%、70.6%;干重分别提高为266.7%、127.8%、88.9%、33.3%。菌悬液同样具有促生作用,细菌浓度为107、106、105CFU/mL时,与对照相比鲜重分别提高为121.7%、83.9%、13.3%;与对照相比干重分别提高为122.2%、66.7%、27.8%。发酵液的促生效果优于菌悬液。2.4olcu/g根浓度为108、107、106、105CFU/mL的菌悬液处理,出苗2d后番茄根际细菌浓度分别为5.5、5.1、4.2、3.8logCFU/g根,4个处理之间根际细菌浓度差异显著;7d后浓度为108、107CFU/mL菌悬液处理的菌量增加,浓度为106、105CFU/mL菌悬液处理的菌量减少,浓度分别为5.8、5.5、4.2、3.6logCFU/g根;此后,根际菌量持续下降,22d后趋于稳定,27d后终浓度为3.8、3.6、3.1、3.1logCFU/g根(图4)。2.5对于番茄个人基因型的影响菌株CF05处理番茄种子发芽率为87.25%,B.subtilis168处理为81.46%,2个处理与对照差异不显著(P>0.05),多菌灵处理后种子萌发率为74.45%,与对照差异显著(P<0.05)。菌株CF05处理后种子萌发率最高,与对照组相比效果提高11.7%,与B.subtilis168处理相比提高7.6%,与多菌灵处理相比显著提高17.2%,说明菌株CF05对种子萌发具有促进作用。菌株CF05处理番茄猝倒病发病率为17.28%,B.subtilis168处理为21.78%,多菌灵处理为13.85%,对照为38.16%,3个处理与对照相比,发病率均差异显著(P<0.05)。其中菌株CF05处理防效比对照防效高38.6%,比B.subtilis168处理防效高20.7%,略低于多菌灵处理,但差异不显著(P>0.05)。3p.poluscyfb基因回复突变试验,主要发生在植物致病和植物微生物本研究经形态特征、16SrDNA序列、生理生化反应特性分析,鉴定1株从柳杉上分离获得对多种病原真菌、病原细菌具有拮抗效果的菌株CF05,鉴定为多粘类芽孢杆菌P.polymyxa。该菌株对番茄幼苗具有显著的促生效果,能提高种子萌发率,稳定定殖于番茄根际,对番茄猝倒病具有明显的防治效果,表现出良好的应用开发潜力。多粘类芽孢杆菌对植物病原真菌的拮抗作用已有大量报道,其作用主要表现在产生真菌细胞壁水解酶等拮抗物质。Dijksterhuis等报道P.polymyxa细胞直接作用于棉花枯萎病菌,说明持续抑制真菌生长要有活菌的存在。P.polymyxaCF05对鞭毛菌门、子囊菌门等真菌都表现拮抗效果,其作用机制可能与细菌产生的真菌细胞壁水解酶相关。多粘类芽孢杆菌能产生多粘菌素、嗜铁素等细菌拮抗物质。与本文报道的P.polymyxaCF05对多种植物病原细菌表现明显拮抗效果一致。P.polymyxaCF05在温室条件下对番茄幼苗具有较好的促生作用,生物量明显增加,而且P.polymyxaCF05的发酵液比菌悬液促生效果显著。其原因可能是通过固氮、溶磷作用产生营养物质或产生激素直接促进植物生长,或者通过抑制植物病原菌间接促进植物生长。P.polymyxa中发现了植物生长素合成通路的相关基因以及吲哚-3-丙酮酸脱羧化酶(IPDC),说明该细菌可以产生植物生长素(IAA)。同时,固氮基因nifH也在多粘类芽孢杆菌中得到克隆,说明该细菌具有生物固氮的特性。P.polymyxa在多种植物上报道可以防治真菌、细菌以及线虫引起的植物病害。P.polymyxa处理植物后,