五灵胶囊中柴胡皂苷d在小鼠体内药代动力学研究

五灵胶囊中柴胡皂苷d在小鼠体内药代动力学研究

五灵胶囊是由柴胡、五味子等中药组成的复方制剂。具有平肝健脾、活血化瘀、治疗乙型慢性肝炎的功效。柴胡在方中为主药,柴胡皂苷d是柴胡中主要成分,具有抗炎、保肝、降低血中胆固醇等药理作用。五灵胶囊中主要成分柴胡皂苷d在小鼠体内的药动学特征未见报道,本文对小鼠ig五灵胶囊后体内柴胡皂苷d的药动学特征进行试验,为临床用药提供实验依据。1材料和方法1.1胡皂苷的提取纯化五灵胶囊(Wuling)由西京医院药剂科中药制剂室提供,批号:20020925;五灵胶囊阴性样品由本室模拟制备:柴胡皂苷d本室提取纯化,白色粉末,熔点212～216°C,经紫外、红外光谱,EI-MS质谱确证,纯度97%。乙腈:色谱级Merck公司;水为三蒸水。日本岛津SCL-6A高效液相色谱仪、C-R3A数据处理器,SPD-6A紫外检测器,硫酸胺为分析醇,西安化学试剂厂;昆明小鼠,购自第四军医大学动物中心,动物合格证号:医动证字SC×K(军)2002-05。1.2试验品溶液的制备乙腈-水(40∶60)流速1.0mL·min-1,检测波长为204nm,柱温:室温。取五灵胶囊和五灵胶囊阴性样品分别ig小鼠5.5g·kg-1,1.5h采血,分取血浆同样品制备方法制备供试品液,再取正常小鼠血浆+柴胡对照品同法制备供试品液。取各样品供试液20μl分别进样测定分析柴胡皂苷d的HPLC色谱图。1.3灵胶囊给药、血样的制备昆明小鼠228只,♂,置相对湿度45%～75%、温度23～25°C动物实验室饲养3日,禁食过夜,随意饮水,按体重分层随机分组,每采血时间点为一组,每组4只,五灵胶囊按5.5g·kg-1ig给药(相当于人体给药剂量10倍,每克药粉含柴胡皂苷d4.1mg),分别于给药后0.16,0.32,0.5,1.0,2.0,2.5,3.0,3.5,4.0,5.0,6.0,7.0,8.0,10.0,12.0,14.0,18.0,20.0,24.0h眼眶采血,置于肝素化的离心管内,室温放置30min,3000r·min-1离心20min,分离血浆,每组血浆合并,置-20°C冻存,待测。药物重复实验3次。1.4单次给药后小鼠血浆中2.受试小鼠204只,♂,试验条件同上,按体重分层随机分为大、中、小3个剂量组,每个剂量组68只小鼠,三剂量组分别按体重灌胃给予五灵胶囊(大剂量16.6g/kg、中剂量11.1g/kg、小剂量5.5g/kg),分别于给药后0.16,0.5,1.0,1.5,2.0,3.0,4.0,5.0,5.5,6.0,6.5,7.0,8.0,10.0,14.0,18.0,20.0h眼眶采血,每个剂量组每个采血点4只小鼠,置于肝素化的离心管内,室温放置30min,3000r·min-1离心10min,分离血浆,合并4只小鼠血浆,置-20°C冻存,待测。观察五灵胶囊3剂量组的主要动力学参数是否一致。1.5样品溶液的制备依时间点取4只小鼠混匀血浆0.7mL,加0.25g硫酸胺,旋涡混匀1min,再加乙腈-甲醇(4∶1)溶液4mL,混悬3min,3000r·min-1离心20min,取上清液置小蒸发皿内,于40°C水浴上用氮气吹干,残渣加色谱甲醇溶解至1mL,摇匀,作为样品供试品液,-20°C放置过夜。次日用0.22μm微孔滤膜抽滤,HPLC进样20μL,测定,外标法计算含量。1.6小鼠血浆中样品液的制备取小鼠20只,随机分成5组,每组4只,禁食给水,次日灌胃给药后1h,小鼠按组眼眶采血,离心分离血浆,每组小鼠血浆合并,混匀,每组分取0.7mL血浆,按血浆样品制备方法制备样品液,多人同法操作共制得5份样品液,HPLC法测得5份样品含量。再取对照样品和供试样品液按样品测定方法测定峰面积并计算含量,照样品和供试样品液放置4°C冰箱内,日内每3h测定1次,共测5次,日间每日测1次,共测5次。2结果2.1小鼠血浆中柴胡皂苷d的分离在此条件下,五灵胶囊吸收入血的其它成分或代谢产物均可达到基线分离,小鼠血浆中柴胡皂苷d可得到良好的分离,峰形基本对称,滞留时间适宜为11.21min。五灵胶囊阴性样品血清和空白血清对测定无干扰,结果见图1。2.2血药浓度测定取空白血浆0.7mL,一式7份,加入柴胡皂苷d对照品溶液,使血浆终浓度分别为6.25,12.5,25,100,200,400,800μg·mL-1,按血浆样品的处理方法操作制备样品并测定峰面积值,以峰面积值对血药浓度作图,得回归方程Y=-6370+1364Cr=0.9999。线性范围6.25～800μg,最低检测限5μg·mL-1。2.3样品制备和回收率取给药后的混合血浆0.7mL,一式2份,一份加已知量的柴胡皂苷d,另一份不加,按血浆样品处理方法操作制备样品,同法连续制备7次回收样品,测定二者峰面积值并计算含量,两者含量之差除以加入柴胡皂苷d的量,得血浆样品百分回收率,结果表明7次回收试验的平均回收率为96.88%,RSD=2%。2.4仪器测定的稳定性柴胡皂苷d对照品的日内差异测定值分别为88540、88899、88459、88563、88748平均值为88641.8±178.47,RSD=0.20%。柴胡皂苷d对照品的日间差异测定值分别为93467、93773,93406、93926、93782,平均值为93670.8±223.38,RSD=0.23%。测得五灵胶囊样品的日内差异含量分别为91.62,91.10,92.11,92.16,91.37μg·mL-1,平均含量为91.67±0.461,RSD=0.50%;测得五灵胶囊样品的日间差异含量分别为88.76、88.70、88.79、89.55、89.96μg·ml-1,平均含量为89.15±0.57011,RSD=0.63%,仪器测定的稳定性符合测定要求,对照品液和供试品液在测试期间是稳定的,可满足测定要求。2人重复性试验测得5组样品含量分别为86.14,85.81,87.61,87.54,88.69μg·ml-1,平均含量为87.158±1.177,RSD=1.35%,同样品多次操作测定含量波动不大,说明此测定方法稳定。2.5药动学参数判断依五灵胶囊给药剂量每克药粉含柴胡皂苷d的浓度,五灵胶囊3剂量组测得血药浓度数据用SIP药代动力学计算机程序进行计算,其主要药动学参数Ke、Ka、T1/2Ke、T1/2Ka、Tmax等不相一致,符合非线形动力学特征。3剂量血药浓度——时间曲线基本相似,见图2。计算所得药代动力学参数见表2。3不同剂量五灵胶囊对体内柴胡皂苷d的药动学从小鼠血浆样品内提取柴胡皂苷d,HPLC法能较好地测定小鼠血浆中柴胡皂苷d含量,回收率与重复性试验证明此方法可行,分离度和稳定性较好,五灵胶囊阴性样品分析表明血浆中其它成分对柴胡皂苷d测定无干扰。中药方剂吸收入血成分复杂,色谱峰较多内标无合适的滞留时间,故采用外标法,同次试验均用血浆对照品与样品同时测定并计算含量,可消除因操作误差所致含量计算差异。五灵胶囊3剂量组的主要动力学参数并不一致,为非线形动力学特证,依据AIC拟合度和拟合优度值数据判断,五灵胶囊所含柴胡皂苷d在小鼠体内药动学过程符合一级吸收单室模型。就峰形而言,五灵胶囊中柴胡皂苷d的药时曲线为双峰,其达峰时和峰浓度各有2个,达峰时分别为1.45h,6.48h,峰浓度分别为83.81μg·ml-1和119.63μg·ml-1,产生双峰可能与肝肠循环有关,按常理肝肠循环的后峰应低于前峰,可本试验结果两峰大致相似,AUC也相等,这后峰为何相似于前峰?柴胡