生物化学：酵母核糖核酸的提取及测定

酵母核糖核酸的提取及测定植物098原硕0901080808摘要：用浓盐法提取酵母RNA，经过多步分离提纯，在现有实验条件下，得到样本RNA含量=67.5%，RNA提取率=1.2%关键字：酵母，浓盐法，RNA含量，提取及测定研究背景及目的：RNA作为细胞中参与基因表达和蛋白质合成的重要物质，在平时学习中多有涉及，本实验通过从酵母中提取RNA，掌握提制RNA的方法并掌握其测定手段，巩固离心机和紫外分光光度计的使用。研究依据及原理：酵母作为工业上大量生产核酸的最为理想的微生物，因为酵母核酸中主要是RNA（2.67~10.0%），DNA很少（0.03~0.516%），菌体容易收集，RNA也易于分离。此外，抽提后的菌体蛋白质，也具有很高的利用价值。RNA提取过程是先使RNA从细胞中释放，并使它和蛋白质分离，然后将菌体除去，再根据核酸在等电点溶解度最小的性质，将pH调到2.0~2.5使RNA沉淀，进行离心收集。提取RNA的方法很多，在工业生产上常用的是稀碱性和浓盐法。本实验采取浓盐法（10%NaCl）核酸不论是DNA还是RNA，都是由核苷酸组成的多聚核苷酸化合物，而核苷酸是由糖，碱基和磷酸构成。要测定生物体内核酸的含量或者测定提取出来的核酸含量，只需要测定组成核苷酸的一种成分，如磷，糖或碱基，便可计算出核糖的含量，因为核算分子中这三个组份是以等分子比例存在的，即每一个嘌呤或嘧啶分子都与一分子戊糖及一分子磷酸相连接的，所以只要测出其中任何一组分的含量即可求出核糖的含量。本实验采用紫外吸收法测定核糖核酸含量，因为核酸的组成成分嘌呤及嘧啶碱基具有强烈的紫外吸收，最大吸收在260mm处，利用此特性可以对核酸进行定量测定。实验材料与方法：材料：干酵母（安琪牌）灰蓝色pH试纸和黄色pH试纸试剂：（1）10%NaCl（2）6NHCl（3）95%乙醇（分析纯）（4）5~6%的氨水（5）RNA沉淀剂取0.5克钼酸铵，加水193ml，加7ml70%过氯酸，总体积200ml。（70%过氯酸即高氯酸，原液浓度即是70%）。仪器：量筒：50ml；具塞试管：15ml×2三角瓶：100ml；容量瓶：25ml×1,50ml×2烧杯：50ml×3表面皿：6cm×1滴管，玻棒，移液器，塑料碗烘箱离心机托盘天平，分析天平匀浆器紫外分光光度计（Rayleigh，UV-9600）实验方法：提取：称取7g酵母，研钵中研磨成粉末，倒入三角瓶中，然后量取50ml10%NaCl溶液，倒入三角瓶，是酵母粉充分彻底悬浮，之后小心放入沸水浴中，浸提半小时。分离：将上述提取液取出，于冰浴中彻底冷却，转入离心管，以3500r/min离心30min。使提取液及菌体残渣等分离。沉淀RNA：将离心得到的上清液，小心倾倒于50ml小烧杯中，并置于冰浴中冷却，待溶液冷却至10℃以下后，于冰浴中在搅拌下（注意不要过分剧烈）小心用6MHCl调节pH至2.0~2.5（用灰蓝色pH试纸），调好后继续于冰水中放置10min。洗涤纯化：将上述悬浊液小心转入离心管，以3000r/min离心10min，得到RNA沉淀。小心倾去上清液，直接与离心管中用95%乙醇洗涤RNA沉淀两次，每次用15ml乙醇，充分搅拌洗涤，然后以3500r/min离心6min。干燥：用牛角勺仔细将洗涤后的RNA沉淀从离心管内挖出涂于事先将边缘折起成框的称量纸上（预先用分析天平称重并记录数据），涂布均匀后，小心置于80℃烘箱内5min左右，使沉淀充分干燥。将干燥后的RNA制品连同称量纸一起准确称重，而后小心将RNA制品的大部分转移至匀浆器中，将称量纸和残余RNA制品再次称重，记录下所有数据。含量测定（紫外分光光度法）：采用比消光系数法，比消光系数本实验中给定A260=0.022。测定步骤：将第5步中得到的溶液,转入小烧杯中，用5%氨水小心调pH至7.0（用黄色pH试纸），最后转入25ml容量瓶，用蒸馏水定容。取两支试管，按下表操作：管号RNA液H2O沉淀剂A5ml5ml——B5ml——5ml摇匀，冰浴20min，转入离心管3500r/min离心10min，小心取上清液，各取0.5ml至50ml容量瓶，蒸馏水定容，其中一个做标准空白液，在紫外分光光度计上测定OD260值。实验结果及计算：原始数据：称取酵母量（样品重）W=7g空白称量纸重W1=0.6048g总制品+纸重W2=0.7282g残余制品+纸重W3=0.6198g比消光系数A260=0.022测定消光值OD260=0.322透光度T=47.6%推演数据：总制品重：G1=0.1234g定量样品重：G2=0.1084g结果计算：RNA含量（%）=E260AV：被测样品体积D：样品测定时的稀释倍数RNA提取率（%）=RNA含量×G1W结果分析：本实验使用浓盐法和紫外分光光度法提取和测定了酵母的核糖核酸含量。实验中，有如下几处可能产生误差，1、研磨时的充分程度，研磨的充分程度的不同，将直接影响最后所能提取到的RNA含量的多少。2、本实验过程中，多次涉及到样品转移、离心、洗涤过程中，将不可避免的造成样品的损失，直接造成最终RNA提取率的下降。3、实验操作过程中，实验人员并未佩戴手套，人体附带的RNase一类的酶可能会造成一定量的RNA分解。4、烘干后的RNA样品很轻，在称量、转移过程中很容易造成损失。综上所述，本实验中一定未能提取出酵母的全部RNA，实验过程中必然造成了样品一定程度上的损失，参考酵母RNA含量（2.67~10.0%），以及在A260/A280=1.983时，90g湿酵母（相当于20g干酵母）可提取1gRNA（选自：李志东邱峰张洪林，《影响浓盐法提取啤酒酵母RNA的工艺参数研究》，《化工技术与开发》2007年第36卷第2期，12页36卷），考虑到本实验的实验条件及上面提到的误差因素，本实验结果在RNA含量和RNA提取率上都基本让人满意。参考文献：李良秋黄晓兰，《高效液相色谱法测定酵母RNA中四种生物碱基的含量》，第二届全国发酵工程学术讨论会第二届全国发酵工程学术讨论会论文集，1998年徐希柱，《啤酒酵母中RNA、β-（1，3）-D-葡聚糖和蛋白质的提取及应用研究》，《山东农业大学》2007年田宝勇赵星洁，《啤酒酵母RNA降解产物5′-核苷酸的高效液相色谱分析》，《酿酒科技》,2008年第3期李珊吴振强，《盐法提取啤酒废酵母RNA的研究》，《酿酒科技》2005年第7期朱俊东黄国荣糜漫天郎海滨，《啤酒酵母中提取核糖核酸的研究》，《食品科学》1602006,Vol.27,No.02廖鲜艳李永仙等，《啤酒酵母胞内RNA提取的研究》，《酿酒》2002年第29卷第2期李志东邱峰张洪林，《影响浓盐法提取啤酒酵母RNA的工艺参数研究》，《化工技术与开发》2007年第36卷第2期曹成喜等，《生物化学仪器分析基础》，2008，化学工业出版社孙培龙吴石金，《生物化学技术实验指导》，2008，化学工业出版社张龙翔张庭芳李玲媛，《生化试验方法和技术》，1997，高等教育出版社思考题：RNA中的嘌呤碱基和嘧啶碱基在不同pH条件下异构情况不同，对紫外光的吸收值不同，摩尔消光系数会随之改变。所以应固定pH值；pH不固定会影响测定结果。因为pH不同的条件下，OD值也会随之改变，而实验中所给的比消光系数是在一定pH值下给定的。所以pH值不固定会影响测定结果。1）加钼酸铵—过氯酸沉淀剂是为了沉淀RNA，然后用得到的上清液做空白对照，以减少定量样品重的蛋白质、糖类等物质对RNA含量测定的干扰；2）由朗博—比尔定律A=εbc，当吸光度在0.2~0.8时，测量误差最小，本实验中ε、b都已固定，只能改变浓度c，是A在上述范围内，所以要稀释。1）总体策略：保持物质活性，结构完整，纯化到所需浓度，能够大量提纯（量产）；2）分离纯化生命大分子时要注意：保持所提取物质活性；抑制或避免接触所能分解被提纯物质的酶，以免物质被酶分解；反应条件应温和，避免能破坏生命大分子的因素。实验小结：酵母作为工业上大量生产核酸的最为理想的微生物，因为酵母核酸中主要是RNA，DNA很少，菌体容易收集，RNA也易于分离。因而本实验使用浓盐法和紫外分光光度法提取和测定了酵母的核糖核酸含量。实验过程中，通过浓盐法提取出样品酵母中的RNA，经过多次分离提纯，最后用紫外分光光度发，通过吸光率，测定了样品中的RNA含量。计算出RNA提取率。实验中从在几处误差，使得实验数据在现有条件下不可避免偏低，但参考酵母RNA标准范围（2.67~1