中药赤芍中拮抗脂多糖的药理学活性检测

中药赤芍中拮抗脂多糖的药理学活性检测

严重烧伤、伤口和感染可由外源性细菌感染或肠内毒素酶波动引起，脓毒症（pi）可能会加剧。脓毒症是临床危机患者死亡的主要原因，死亡率为56%-60%。目前已证实,革兰阴性菌内毒素(endotoxin),即脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是引起脓毒症的主要启动子。赤芍为毛茛科芍药PaeoniaLactiflraPall或川赤芍PaeoniaVeitchiiLynch的干燥根。属传统的活血化瘀类中药,其味苦,微寒,归肝经。具有清热凉血,散瘀止痛之功能。现代药理研究表明其具有抗凝、抗血栓、抗氧化等广泛的生物活性,能够用于心血管、肝脏等多种疾病,最近的研究表明赤芍具有很强的抗LPS作用,我们在前期的研究中发现,赤芍含有很高的具有与LPS发生结合作用的物质并从中分离出6个具有拮抗LPS作用的组分,笔者就是对这6种赤芍有效组分进行体外拮抗LPS的实验研究,从药效学角度深入探讨其物质基础,进而阐明其作用机制、明确其临床适应证,将具有重要的学术及临床价值。1材料和方法1.1材料表面1.1.1细胞、mtt和tnf-elisa试验LPSO111:B4(美国Sigma公司),LPS检测鲎试剂(广东湛江安度斯公司),DMEM细胞培养液(美国Hyclone公司),MTT溶液(美国Sigma公司),小鼠RAW264.7细胞(购自ATCC),小鼠TNF-αELISA试剂盒(北京晶美公司)。1.1.2elisarap3-el模型EDS-99LPS定量测定系统(广东湛江安度斯公司),ELISAReader酶标仪(瑞典Biochrom公司),二氧化碳孵箱(美国Thermo公司),水平离心机(上海科学仪器厂),低温高速离心机(美国Beckman公司)。1.2方法1.2.1两组细菌lps表达水平将前期分离提取得到的6个赤芍提取物组分与定量的LPS标准品等体积混合,配成终浓度为:赤芍各组分为50mg/ml和LPS1EU/ml,PMB组为对照,剂量为50mg/ml,放入水浴箱,37℃孵育20min后,取100ml混合后的样本加入到100ml的鲎试剂,按照EDS-99细菌LPS测定系统(动态浊度法)操作方法进行,测定中和后的LPS值,结果以EU/ml报告,并计算中和率:LPS中和率=(总LPS实测值-中和后LPS实测值)/总LPS实测值。1.2.2小鼠细胞中lps表达的检测将来自ATCC的冻存单核细胞株RAW264.7细胞复苏,置37℃5%CO2培养箱中培养2～3d后分瓶传代,最后离心收集细胞,通过细胞计数得到0.5×106/ml的细胞后加入到96孔培养板中,每孔200μl。实验中分两组,一组在培养的小鼠RAW264.7细胞中加入终浓度为80mg/ml的赤芍各组分,并同时加入终浓度为100ng/ml的LPS,并以已经明确抑制LPS的多粘菌素B(PMB,终浓度为80mg/ml)为对照;另一组在培养的小鼠RAW264.7细胞中加入赤芍各组分后只加入等体积于LPS的PBS为空白对照组,在CO2培养箱中孵育4h后取上清,用ELISA的检测试剂盒测定TNF-α的含量。1.2.3心肌病原代培养rpm为了排除赤芍组分本身的原因造成细胞死亡而影响细胞因子的检出。选择最有活性的赤芍1组分来检测对细胞活力的影响,将培养3h后的RAW264.7细胞,加入不同浓度的赤芍1组分:LPS组加入100ng/ml的LPS),继续培养2h。将培养板置离心机,1000rpm离心5min,使细胞全部贴壁,小心吸去上清,PBS轻轻洗涤,再次离心。每孔加入200ml新鲜DMEM培养液,再加入20mlMTT溶液(5mg/ml),37℃继续培养4h后,终止培养,1000rpm离心10min,小心吸去孔内培养液,每孔加入150ml二甲基亚砜,置摇床上低速振荡10min,使结晶物充分溶解,在酶标仪490nm处测量各孔的吸光值。1.3统计分析方法所有的计量资料均以x¯±sx¯±s表示,采用SPSS(statisticalpackageforthesocialscience)统计软件包进行分析,两组比较采用t检验,多组之间比较采用方差分析。以P<0.05为差异显著,P<0.01为差异非常显著。2结果2.1体外低表面活性剂的凝集反应对内毒素的中和作用是抗内毒素物质抑制内毒素生物学效应的主要方式。体外的LPS中和实验结果显示赤芍1～6组分均能够抑制LPS催化的鲎试剂凝集反应。其中赤芍第1、4、5、6组分效果十分明显。结果见表1。2.2抑制tnf-fsh的效果首先根据标准品的测定结果绘制标准曲线,结果见图1。根据标准曲线换算出样本的TNF-α结果,见表2。2.3赤充1组细胞活力检测从以上的结果可以看出赤芍1组分抑制LPS刺激小鼠单核细胞释放TNF-α效果最明显,因此对赤芍1组分进行细胞活力检测具有代表性,测定结果见表3。结果显示赤芍1组分与空白及LPS组之间几乎没有明显的差异,说明赤芍对细胞的活性不产生影响。排除了可能是由于赤芍本身的原因造成细胞死亡而影响细胞因子的检出。3赤充物体作用机制的研究脓毒症是机体在感染后发生过度炎症反应所引起的一种复杂的临床综合征,进一步发展可导致脓毒性休克、多器官功能衰竭(multipleorganfailure,MOF)甚至死亡,是目前临床危重患者的主要死亡原因之一。由LPS引起的系统性炎症反应综合征和脓毒症在中医理论属于温病、热症等范畴,传统的中医中药治疗脓毒症时主要采用清热解毒、气营两清、回阳救逆等方法。赤芍为毛茛科植物芍药或川赤芍的干燥根,属传统的活血化瘀类中药,具有清热解毒、凉血化瘀等功能,现代药理研究表明其具有抗凝、抗血栓、抗氧化等广泛的生物活性,能够用于心血管、肝脏等多种疾病。目前对赤芍抗LPS作用的物质基础仍不清楚,因此从药效学角度深入探讨其物质基础,进而阐明其作用机制、明确其临床适应证,将具有重要的学术及临床价值。我们将不同组分的赤芍提取物与1EU/ml的LPS共同孵育20min后,再用定量鲎试验测定游离的LPS值,结果显示6个组分的赤芍能够分别中和LPS的60.3%、32.3%、48.9%、88.4%、67.7%和55.8%。该结果也提示赤芍6个组分与LPS的结合作用具有中和活性,它们与LPS的结合位点可能就是LipidA。由于LPS分子中负电荷的数量、位置与LPS分子的空间构象和活性密切相关,只有在负电荷的相互作用下,构象成圆锥形,LPS才具有活性,赤芍有效组分与LipidA所带负电基团的结合,可能改变了LPS分子的阴离子特性,从而影响了LPS分子的构象,最终影响了它对鲎试剂的凝结反应。LPS活化单核细胞后,释放TNF-α等细胞因子,介导脓毒症的发生。TNF-α被认为是在LPS休克病程中最早释放且起关键作用的介质。LPS与巨噬细胞结合后,通过一系列的细胞内信号传导,激活NF-κB,迅速诱导TNF-αmRNA的合成,导致TNF-α的大量释放,TNF-α在LPS介导的病理损害中的主要作用为:诱导一氧化氮的合成;介导血小板活化因子、前列腺素等脂类介质以及IL-1、IL-6等炎性介质的产生;诱导氧自由基的产生及脂质过氧化损害。研究表明,TNF-α和LPS的检出水平与病情及预后密切相关。通过体外培养的小鼠RAW264.7细胞研究显示,赤芍6个组分中1、4、5组分对TNF-α释放的抑制作用显著。进一步观察赤芍1组分对小鼠培养细胞的影响(MTT实验)。MTT能定量反映活细胞的数量或细胞活性的变化。LPS的测定结果为0.227±0.0294,不同浓度