肝纤维化过程中上皮-间充质转化的研究进展

肝纤维化过程中上皮-间充质转化的研究进展

肝纤维素质炎是肝脏应对各种疾病（炎症、酒精、寄生虫、化学物质、免疫、营养代谢障碍等）刺激的自我恢复反应。损伤的肝细胞分泌了几种遗传因子，激活了肝星形细胞，并将其转化为肝肌强化细胞（mfb）。mfb通过旁入和自分泌功能产生以沉积物为主要成分的大量细胞外基质（mcclovac）。通过残留和转化亚甲基物质，肝纤维素最终进入肝硬化和肝癌。近年研究证明,肝纤维化过程存在上皮-间充质转化(Epithelial-mesenchymaltransition,EMT)现象,这为抗纤维化药物的开发提供了新的靶点。本文综述了可能参与转化的各种肝内细胞及涉及EMT的调控信号通路,并在此基础上,探讨了以EMT为靶标的抗肝纤维化治疗策略的可行性及研究进展。1emt的组成及作用机制EMT是指分化成熟的极化上皮细胞在外界因素的刺激下,获得某些间充质细胞的特征(如极性丧失、细胞骨架蛋白改变和成纤维细胞样外形等)使其具有更强的活性和迁移性。早在1982年,Greenburg等在培养晶状体上皮细胞时就发现这些细胞在胶原凝胶中可以获得间充质细胞样形态,首先提出了EMT的概念。EMT与多种生长因子和转录调节因子有关,可通过多条信号转导通路起作用,在胚胎发育、损伤修复、组织纤维化、肿瘤的发生、发展、转移及耐药性等方面都有着重要的作用。EMT主要由四步组成:(1)失去上皮黏附特性;(2)表达平α-平滑肌肌动蛋白(Alpha-smoothmuscleactin,α-SMA),肌动蛋白重排;(3)基底膜瓦解;(4)细胞移动性和侵袭性增强。具体表现为细胞形态由立方型变成梭形,类似成纤维细胞形态,电镜下可见细胞失去极性,微绒毛消失,与周围细胞和基质的接触减少,细胞黏附力下降,细胞内出现密体,胞质内出现大量肌动蛋白微丝,迁移和运动能力增强。同时细胞表型发生改变,上皮细胞的标志物如E-钙黏蛋白、α-连环素、β-连环素、γ-连环素、桥粒斑蛋白、紧密连接蛋白、角蛋白、黏蛋白等表达下调;而间质表型标记物表达上调,如成纤维细胞特异性蛋白-1(Fibroblastspecificprotein-1,FSP-1)、波形蛋白、纤维连接蛋白、N-钙黏蛋白等。如果细胞在过渡阶段,两类细胞标志可同时表达。2emt与肝纤维化对于慢性脏器纤维化疾病,EMT有两方面的双重作用:一方面,通过EMT,分泌ECM的成纤维细胞或MFB越来越多;另一方面,EMT导致了上皮细胞的大量流失,加剧纤维化组织的实质结构破坏。Xu等指出EMT中上皮细胞获得了成纤维细胞的表型,出现间质细胞标志物,最终可能发展为MFB,促进肝纤维化的发生与发展。Kuroda等也认同这一观点,认为间质成纤维细胞是具有间质细胞表型的一类细胞,而MFB则是一类活化的间质成纤维细胞,表达独特的分子标记蛋白α-SMA,在一些细胞因子如转化生长因子β(TGF-β)等的刺激下,这些在EMT过程中生成的间质成纤维细胞就可转变为MFB,促进肝纤维化的发生发展。慢性肝损伤包括缺氧、炎症和病毒感染等导致肝纤维化的发生,研究证明这些损伤诱发肝内细胞EMT。Bose等研究结果显示,丙型肝炎病毒(HepatitisCvirus,HCV)通过激活AKT/β-连环素信号通路诱导人原代肝细胞发生EMT。他们用病毒感染体外培养的人原代肝细胞,发现细胞表现出成纤维细胞样形态,且波形蛋白、FSP-1、snail、slug和twist的表达上调,上皮细胞标志物E-钙黏蛋白表达下调。感染病毒的纤维化肝组织活检,也发现snail、twist基因表达上调,证明EMT参与病毒感染导致的肝纤维化。丁型肝炎病毒也能通过激活TGF-β信号通路,诱导EMT和纤维化的发生。慢性损伤的肝脏由于肝内血管分流、肝静脉阻塞、肝窦面积减少、肝窦毛细血管化等因素导致缺氧微环境的产生,这一病理改变通过多种机制诱导、促进肝纤维化。Copple等研究提示缺氧能够通过缺氧诱导因子(Hypoxiainduciblefactors,HIFs)依赖的信号机制诱导肝细胞发生EMT。他们通过体外原代肝细胞缺氧实验、体内胆管结扎动物肝纤维化模型实验,证明缺氧环境下肝细胞上皮标志物表达下调,同时间质细胞标志物表达上调,而HIF缺陷的细胞和小鼠不发生这种变化。给予TGF-β受体抑制剂,这种诱导作用被抑制。Lopez-Novoa等认为慢性炎症这一普遍存在于纤维化器官的微环境也是EMT的强力诱导因素。如果这些间接证明EMT参与、促进肝纤维发展进程,下面这些研究将提供更直接更具说服力的证据。2008年,Diaz等人运用免疫染色方法,检测胆道闭锁和其他肝脏疾病病人的肝组织样本,发现在胆道闭锁、原发性胆汁性肝硬化等胆小管增生肝疾病中胆管上皮标志物CK19和EMT发生标志物FSP-1、胶原伴侣分子热激蛋白-47、波形蛋白等共定位,在正常肝组织中不存在这种现象。Omenetti等更是通过体内动物实验证明了在胆管性肝纤维化中EMT的发生,并且阐明SHH参与调节EMT发生,促进纤维化进程。Harada等研究结果显示胆管上皮细胞对呼肠孤病毒双链RNA的先天性免疫反应产生碱性成纤维细胞生长因子诱导EMT发生,EMT促进胆管硬化病变。在非酒精性脂肪肝(Nonalcoholicfattyliverdisease,NAFLD)中,Syn等发现SHH信号通路介导小管细胞发生EMT,促进NAFLD向肝硬化转变。以上研究充分证明了在胆管闭锁、NAFLD等肝脏疾病中,肝内细胞发生EMT,参与组织纤维化病变,促进肝纤维化向肝硬化转变的进程。3动物肝功能模型之前研究认为组织纤维化过程中,因为EMT的发生,上皮细胞是“受害者”,但越来越多的研究证明,其是参与者,直至扮演“罪魁祸首”的角色。肝上皮细胞(肝细胞、胆管上皮细胞、肝祖细胞)在体外培养、动物肝纤维化模型中发生EMT,参与肝纤维发生发展。肝星状细胞由其来源的特殊性,也可能发生EMT参与纤维化进程。3.1第三,下皮细胞在肝纤维化过程中发生emt的结果胆管上皮细胞衬附于从赫令管到胆总管十二指肠开口的所有胆管,参与水、电解质的运输,分泌、表达与炎症相关的细胞因子、黏附分子等生物学过程。目前认为各种致病因素导致的胆管上皮细胞发生间充质细胞和纤维细胞的转化是导致肝纤维化的主要病理进程之一。Omenetti等研究原发性胆汁性肝硬化患者的肝脏标本,发现FSP-1阳性的胆管上皮细胞数显著高于正常组。在胆管结扎诱导的大鼠胆汁性肝纤维化模型中胆管上皮细胞内FSP-1mRNA水平是正常对照组的10倍,但水通道蛋白-1、细胞角蛋白-7、CK19等胆管上皮细胞标志蛋白的mRNA水平较对照组明显降低。将小鼠未分化的胆管上皮细胞与激活的肝星状细胞共培养,发现小鼠胆管上皮细胞发生了表型的转变,证明胆管上皮细胞EMT的发生。据这些结果他们提出胆管上皮细胞在慢性胆汁淤积性肝病中发生EMT,EMT促进胆汁淤积性肝纤维化的发生和发展。Díaz等的研究也得到了相同的结果。然而与上述结果有争议的是,Scholten等利用Cre重组酶将黄色荧光蛋白(Yellowfluorescentprotein,YFP)基因导入小鼠CK19阳性的胆管上皮细胞,使大于40%的CK19阳性的胆管上皮细胞表达YFP,随后通过胆管结扎或给予CCl4诱导构建小鼠肝纤维化模型,运用免疫荧光染色法发现表达YFP的CK19阳性胆管上皮细胞并未表达α-SMA、FSP-1、索蛋白,据此提出胆管上皮细胞在肝纤维化过程中并未发生EMT。但我们应该注意的是,他们的荧光标记技术只能保证40%左右的胆管上皮细胞呈YEP阳性,大部分的细胞未能得到标记。3.2对大鼠肝调湿的tgf-表达的影响肝细胞是构成肝小叶的主要成分,功能复杂,参与各种物质的合成、分解、转化、分泌等。肝细胞也可能通过EMT促进肝纤维化发生。TGF-β刺激大鼠原代肝细胞或肝细胞株,其上皮细胞特异基因表达下调,如白蛋白,而α-SMA、胶原、FSP-1等间质细胞的标记物表达上调,细胞迁移能力增强。从CCl4大鼠肝硬化模型分离出来的肝细胞,表现出明显的间质细胞特性。以上研究说明,在肝损伤或其他因素刺激下,肝细胞能通过EMT转化为间质细胞,加剧肝实质结构的破坏。3.3肝祖细胞标志和间充质细胞标志肝祖细胞是小上皮细胞,当肝细胞或胆管上皮细胞损伤丢失时可被激活,在体内外具有分化成这两种细胞的的双向潜能。Sicklick等发现,体外培养的小鼠及人肝祖细胞可以共表达上皮细胞标志和间充质细胞标志,提示肝祖细胞可能发生EMT。在TGF-β诱导肝纤维化过程中发现,部分恒河猴肝祖细胞上调间充质细胞相关基因,包括snail-l、柃型纤溶酶原激活物抑制剂及柃型胶原,下调上皮细胞相关基因,包括E-钙黏蛋白、CK18,表达α-SMA,波形蛋白。这些研究表明,肝祖细胞也具备EMT的特性,在特定条件刺激下可通过EMT发挥促纤维化作用。3.4gfap-cre对上皮细胞的激活作用检测有研究认为,胚胎发育过程中,肝星状细胞由间质细胞衍生而来,这类间质细胞又由邻近的原始腔上皮细胞通过EMT转化而来。由此,研究人员提出肝星状细胞实际是由上皮细胞通过EMT生成的概念。Dong等认为肝星状细胞可能是肝祖细胞的来源之一,传统的以肝星状细胞为靶点的抗肝纤维化治疗会导致肝祖细胞的减少。Liu等的研究更是认为肝星状细胞就是一种祖细胞,2008年他们利用基因谱系方法,通过产生(GFAP-Cre/GFP)双转基因小鼠,发现在肝损伤的刺激下肝星状细胞同时表达间质细胞和肝祖细胞的标志物。并且在特定的培养条件下,体外培养的肝星状细胞产生了肝细胞和小管细胞,说明肝星状细胞是一种肝祖细胞,经过一个间质细胞的过渡期可以转化为上皮细胞参与肝损伤修复。整合素连接激酶(Integrin-linkedkinase,ILK)是EMT信号通路中的重要细胞因子,体内试验、体外培养时发现肝星状细胞高表达ILK,这种表达上调无论在CCl4诱导的肝纤维化还是胆管结扎导致的肝纤维都存在。2002年,Lim等研究发现,体外培养的人肝星状细胞表达CK18和CK19,但是随着培养时间的延长,这两种因子表达下调,CK18和CK19被认为是上皮细胞的标志物,所以他们认为肝星状细胞是上皮细胞源的,激活的过程实际上是EMT的过程。2006年,他们进一步研究发现,静息态的肝星状细胞表达E-钙黏蛋白和β-连环素,在激活的过程中,E-钙黏蛋白转变为了N-钙黏蛋白,说明该过程有EMT的发生。肝星状细胞在慢性肝损伤时激活转变成MFB,是肝纤维化发生的关键环节,其激活机制还不十分清楚,EMT是否是调节机制之一,还需要进一步研究,但毋庸置疑的是肝星状细胞具备EMT∕间充质-上皮转化(Mesenchymal-epithelialtransition,MET)的特性。4肝源asi的细胞分子机制和信号跟踪路径4.1联合用药机制诱导emtTGF-β1是公认的EMT诱导剂,可单独诱发并完成整个EMT过程,导致纤维化的发生。TGF-β1是一种同源二聚体多肽分子,相对分子质量25000,参与调节细胞的存活、分化、迁移、黏附和合成ECM成分等诸多生物学过程。目前研究较为清楚的是TGF-β1通过Smad信号转导机制诱导EMT。TGF-β1通过结合细胞膜上TGF-β1受体激活胞内Smad2/3复合体,激活的Smad2/3与Smad4结合,发生构象改变,并移位至细胞核,与各种转录因子、转录辅助阻遏因子、转录辅助活化因子相互作用,从而调节靶基因的转录。Zeisberg等研究证实TGF-β1信号通路参与肝脏上皮细胞EMT过程。将Smad途径与EMT联系起来的重要分子是ILK。Smad4转位至胞核内激活ILK,ILK表达增加导致细胞间黏附分子E-钙黏蛋白的表达抑制,纤连蛋白的表达增加,基质金属蛋白酶-2、基质金属蛋白酶-9的表达和分泌增加,后两者可降解基底膜组成成份,破坏其完整性,使发生转分化的上皮细胞有可能进入间质,促进EMT的发生。另外,ILK可磷酸化细胞骨架蛋白增加转化后细胞的收缩、移动、侵袭能力。这些作用的产生均需要Smad通路保持完整。4.2mapk与erk表达参与EMT的众多信号转导途径中,除了Smad途径,还有非Smad依赖的信号转导途径。在非Smad途径中,其中重要的一条通路就是广泛存在于各种细胞内的丝裂原活化的蛋白激酶信号通路(MAPK信号转导通路),该通路以MAPKKK(MAPKkinasekin)-MAPKK(MAPKkinase)-MAPK级联反应的方式相继磷酸化激活,将细胞外信号转导至细胞内以及细胞核中,调控细胞周期和基因表达。MAPK包括胞外调节激酶(Extracellularregulatingkinase,ERK),JNK/SAPK(C-JunNterminalkinase,INK/Stressactivatedproteinkinase,SAPK)和P38MAPK。ERK包括ERK1和ERK2,Zhong等研究表明,ERK1的表达上调可使胆管细胞、肝细胞中TGF-β、snail及波形蛋白等表达上调,而E-钙黏蛋白的表达下调,表明ERK信号途径的激活参与了胆管细胞和肝细胞的EMT。糖基化终末产物也可通过受体诱导EMT发生,其细胞内直接通路就是通过MEKI-ERKl∕2途径,该途径不依赖TGF-β1的作用,应用受体中和抗体可以阻断该通路的活化,并抑制EMT。4.3tgf-1诱发emt已有研究证明,肝脏的多种细胞可通过EMT转化为MFB,促进肝纤维化的发生和发展,而这一过程还伴随着Notch通路的活化。Notch通路可通过TGF-β/Smad3途径诱导EMT,促进肺间质纤维化的发展。在肾小管的EMT过程中,Notch通路是TGF-β1诱发EMT的重要通路,且Notch通路阻滞剂可以阻止TGF-β1诱发EMT。在腹膜透析所致的腹膜纤维化中TGF-β1诱导Notch通路活化,EMT发生,阻断通路活化,可改善腹膜纤维化,成为目前治疗腹膜纤维化的新方法。张志波等应用RT-PCR方法检测胆道闭锁(BA)患儿肝脏组织胚胎发育基因Notch基因受体基因HES1的表达情况,在正常婴儿肝脏组织中几乎没有HES1表达,在BA患儿肝脏组织中明显增强,表明在正常婴儿肝脏组织中Notch的表达处于静止状态,而在BA早期患儿肝脏组织发生硬化的早期,胆管上皮细胞通过EMT机制转化为产生胶原成分的间充质细胞,导致BA肝纤维化,胚胎发育相关基因也迅速激活。由于BA组几乎都是3个月之内的患儿,属于病变早期,因此他们认为在BA导致的肝硬化早期,Notch是反映EMT过程的较灵敏指标,并且在这一过程中可能发挥重大作用。4.4shh信号通路SHH(Sonichedgehog)信号通过调节不同类型的Hh反应性前体细胞的活性和迁移性起到控制组织重建和塑形的作用。SHH信号可通过成纤维细胞生长因子(Fibroblastgrowthfactor,FGF)、Notch、TGF-β等一系列细胞信号通路的激活间接导致EMT的发生。Omenetti等通过实验证实胆管上皮细胞EMT可以被Hh中和抗体所抑制,表明Hh蛋白是胆管上皮细胞EMT过程中重要的调节蛋白。4.5其他信号通道和intet5化的发生发展肝脏损伤后肝上皮细胞(如肝细胞、胆管上皮细胞、肝祖细胞)以及肝星状细胞发生EMT,促进肝纤维化的发生发展。EMT是一个动态的可逆过程,以EMT为靶标的抗纤维化治疗,有望成为肝纤维化临床治疗的一个新策略。EMT的发生与细胞微环境的改变密切相关,涉及多条信号通路和多种细胞因子,以下从EMT信号通路的阻断和转化细胞所处微环境的改善两方面阐述以EMT为靶点的抗纤维化治疗方法。5.1其他特殊疾病的治疗目前,多种信号分子被陆续证明可以抑制甚至逆转EMT的发生,包括一些内源性的。外在的中和抗体、化学药物等,以及RNA干扰(RNAinterference,RNAi)和microRNA(miRNA)技术,在以EMT为靶标的肾纤维化、肺纤维化、肝纤维化等脏器纤维化疾病的治疗中,都取得了良好的效果。5.1.2hs与emt/脏器纤维化地塞米松通过下调TGF-β1和p-Smad3,上调Smad7分子的表达,抑制细胞EMT。H2S与EMT或脏器纤维化的关系研究相对较少,但已有的报道结果均提示H2S可延缓EMT或脏器纤维化进程。血管紧张素Ⅱ受体1拮抗剂、己酮可可碱等对EMT也有明显抑制作用。考虑到外源药物的副作用,也有研究应用外源药物诱导内源性信号分子的表达,从而达到治疗疾病的目的。5.1.3mir-30对emt表达的调控RNAi是指在进化过程中高度保守的双链RNA诱发同源mR-NA高效特异性降解的生理现象。microRNA(miRNA)是一类内生的、在进化上高度保守的长约20~24个核苷酸的非编码单链小RNA,通过翻译抑制调控基因表达。RNAi技术和miRNA在疾病治疗上的应用十分广泛。RNAi技术应用于抗纤维化的基因治疗,研究结果显示pshRNA-WT1和pshRNA-Pax2能特异性地沉默WT1和Pax2的表达,基因沉默后发生EMT转化的细胞α-SMA和Snail的表达减少,E-钙黏蛋白的表达恢复,细胞未发生明显的成纤维化样改变,提示WT1和Pax2是EMT的关键基因,阻断WT1和Pax2的重新表达有望终止EMT及肾纤维化的发生。Kaimori等发现Smad4-siRNA可以使Smad4基因沉默,抑制Smad4与Smad2/3复合体的结合,从而抑制TGF-β1/Smad信号通路。并利用TGF-β1诱导小鼠肝细胞EMT实验证实未转染Smad4-siRNA的小鼠肝细胞与实验组相比,肝细胞内白蛋白和E-钙黏蛋白水平明显降低,而Ⅰ型胶原合成水平明显增高。因miRNA在基因表达水平的调控特性,使其有望成为肝纤维化基因治疗的利器。Zhang等人研究发现miR-30通过作用于Snail-1,显著抑制肝细胞株AML12细胞的EMT,提示miR-30具有抗纤维化的作用。EMT涉及多条信号通路,众多因子参与,阻断、抑制其中一条,其他通路将会补偿,要从根本上抑制甚至逆转EMT达到治疗脏器纤维化的目的,从EMT的诱因、转化细胞所处微环境的改善上入手不失为更好的策略。5.2低蛋白饮食及lpd的用量是抑制emt的重要因素慢性肝损伤如缺氧、炎症、病毒感染等诱导EMT的发生,说明细胞微环境的改变,是EMT发生的重要原因之一。Ⅰ型胶原促进EMT,而Ⅳ型胶原抑制EMT,而Ⅰ型胶原和Ⅳ型胶原分别是间质和小管基底膜的主要成分,提示微环境信号在表型转化中发挥重要作用,这也表明小管基底膜完整性是体内EMT的一个决定因素,在体外破坏小管基底膜的成分和完整性导致EMT的发生。鉴于上述原因,改善环境从而抑制EMT,达到治疗纤维化的目的,是临床治疗的新思路。低蛋白饮食(Lowproteindiet,LPD)+α-酮酸(α-KA)及LPD均有抑制大鼠肾组织EMT作用,LPD+α-KA的这一作用更显著。虫草多糖通过下调ILK抑制EMT,从而显著减轻肾小管间质纤维化,其具有多方面的生物活性如抗氧化,这两方面作用的协同是减轻纤维化的重要原因。6促进抗肝纤维化的药物治疗肝脏损伤时,肝上皮细胞(肝细胞、胆管上皮细胞、肝祖细胞)、肝星状细胞发生EMT,参与、促进组织纤维化的发生发展。虽然其具体机制还有待进一步的研究阐明,仍需体内实验的有力证据,但其参与、促进的作用已经明确。以EMT为靶标的抗肝纤维化治疗,为临床肝病治疗提供了新的思路和希望。由于其过程的复杂性,机制的进一步阐明将有助于开发新型有效药物