改良线栓法大鼠大脑中动脉阻塞再灌注模型的有效性评价

改良线栓法大鼠大脑中动脉阻塞再灌注模型的有效性评价

采用lagoon法制备大脑中动脉阻塞模型（mcoa），不需要打开颅骨，对动物病理刺激小，模型重复稳定，术后动物生活状况稳定。但传统线栓法MCAO模型需要分离结扎翼腭动脉和颈外动脉,造模时间长、动物出血多、死亡率高。本研究尝试仅分离并结扎颈总动脉,于颈内外动脉分叉处插入线栓,而不分离颈外动脉和翼腭动脉。通过比较两种方法制作模型的耗时、模型成功率、梗死率、死亡率等指标以及脑组织形态学改变来评价改良线栓法制作MCAO的有效性。1材料和方法1.1ley大鼠ley12只SPF级雄性Sprague-Dawley大鼠,体重240～280g,由上海西普尔——必凯实验动物有限公司提供质量许可证:SYXK(沪)2003-0026。1.2实验方法1.2.1蚊香边的4-0手术技术按照ZeaLonga等的方法并稍加改进。选用长3cm,直径0.22mm的4-0手术缝线,头端于蚊香上边烧灼边旋转,使之成光滑圆球状。距头端2.0cm处作好刻度标记,硅油浸泡48h使之硅化。1.2.2颈外动脉远心端模型的制作术前12h禁食,自由饮水。大鼠均选择右侧大脑为梗塞侧,左侧为正常对照。麻醉前随机编号分为对照组和模型组。用16%水合氯醛以350mg/kg剂量行腹腔注射麻醉后,仰卧固定于木板上。对照组:参考ZeaLonga等方法。正中切口约3cm,钝性分离两侧甲状腺,暴露右侧胸锁乳突肌和胸骨舌骨肌间的三角区。分离颈内动脉至鼓泡,仔细分离并结扎翼腭动脉。电凝右侧颈外动脉远心端后,用显微动脉夹暂时夹闭颈总动脉,将颈外动脉残端牵向外下方,使之与颈内动脉呈一条直线,在颈外动脉残端距颈总动脉分支约3mm处剪一小口,将线栓自颈外动脉插入颈内动脉,轻柔缓慢向前推进约(19.5±0.5)mm(自分叉处计),遇阻力时即停止进线,将线栓与颈外动脉共同结扎以固定线栓,松开动脉夹,缝合切口。此时封闭了大脑中动脉开口,阻断了大脑中动脉的血流,制成MCAO模型。阻断2h后暴露颈部切口,缓慢拔出线栓2～3mm实现再灌注。动物在手术中及手术后用白炽灯照射,保持肛温36℃～37℃。模型组:联合曹勇军等和吴莹等的方法,不分离和结扎翼腭动脉。结扎右颈总动脉远心端后,颈内动脉近心端挂线,于颈总动脉近颈内外动脉分叉处以显微剪剪开一小口子,直视下缓慢插入线栓。缓慢推进尼龙线至其入颅,遇阻力时即停止并检查暴露于动脉外的部分,即线栓由颈内外动脉分叉处计长度为(1.9±0.5)mm。若长度只为(16±0.5)mm左右则需要调整颈内动脉方向再次尝试插入线栓。三次尝试不行则视为模型制作失败。其余同对照组。1.2.3神经功能评估按Zealonga等神经功能5分制评分。术后评1～3分者为手术成功的标志。0分、4分及5分均视为模型制作失败。1.2.4梗死灶体积、整脑体积测量再灌注24h后行断头取脑,按文献方法自额极开始行连续冠状切片,每片厚约2mm,共5片。迅速将脑片置2%TTC溶液中染色,数码相机照相(嘴侧面和尾侧面分别照相),采用Imageproplus5.0软件测量各区面积,参照罗勇等的方法计算梗死灶体积和整脑体积:V=∑(Sl+S2)⋅d/2V=∑(Sl+S2)⋅d/2公式中V为总体积;S1、S2分别表示切片头侧、尾侧面积;d为切片厚度。计算梗死灶体积占整脑体积的百分比,用梗死率(infarctionratio)表示梗死灶的大小,将所得值用于统计学处理。1.2.5观察指标记录模型制作时间(从切皮至缝合切口,不包括再灌注的时间),模型成功率,动物死亡率,神经功能评分和梗死率。1.3统计方法各组数据均以均数±标准差表示,两组间差异用配对t检验,用SPSS11.5软件处理。2结果2.1大鼠解剖结果对照组采用传统方法结扎翼腭动脉,颈外动脉插线栓共有6只,死亡1只。模型制作时间(30.83±4.62)min,成功率83.33%,死亡率16.67%。死亡大鼠解剖发现为蛛网膜下腔出血。模型组采用不结扎翼腭动脉,颈总动脉插线栓6只全部存活24h以上,除1只多次尝试仍未成功插入颈内动脉,其余模型制作均成功。模型制作时间(20.17±4.88)min,与对照组比较差异有显著性(P<0.05)。模型成功率也为83.33%。2.2梗死灶位置检测对照和模型两组大鼠神经功能缺失明显,分别为2.20±0.84和2.60±0.55;均可见明显白色梗死灶,梗死率分别为(23.03±7.94)%和(18.65±2.61)%,见图1。两组神经功能评分和梗死率差异无显著意义(P>0.05)。2.3梗死部位大脑皮质细胞结构改变对照组和模型组正常侧大脑皮层神经细胞结构完整,大小一致。胞膜清楚,胞浆均匀,胞核圆大,核膜完整(图2)。梗死部位大脑皮质部分细胞消失,结构破坏,数目减少,排列紊乱,细胞体积大小不一,形态不规则,部分细胞空泡样变,胞核深染,核膜不清,核仁不明显。间质疏松,呈网状改变(图3)。缺血半暗带明显,神经细胞稍小,形态基本正常,排列规整,部分胞浆均质红染,核膜清楚,间质疏松(图4)(图1～4见彩插3)。3讨论3.1大鼠sd大鼠实验Markgraf等研究发现,Wistar大鼠MCAO平均脑梗死体积最小,梗死灶变异大;Fischer2334大鼠梗死灶最大,变异最小;而SD居两者之间。龚彪等研究发现SD大鼠较Wistar大鼠出血更少,操作容易。SD大鼠在MCAO后梗死体积较大而恒定,且性温和、生长快、价格便宜,故常用SD大鼠。为排除雌激素对实验结果的干扰,本实验使用雄性SD大鼠。在动物体重方面,多数研究认为选用280～350g的大鼠较为理想。本人在预实验时发现体重大于280g的大鼠模型不易成功,可能与选择的栓线粗细不同有关,故本实验选用体重240～280g之间的雄性SD大鼠。3.2背景线球面线栓制备合适的“线栓”是保证制模成功、梗死体积稳定的关键。笔者将4-0普通缝线头端用蚊香烧灼,边烫边旋转缝线使其头端呈光滑圆球状,然后置于硅油中48h使之硅化。这样制成的线栓粗细合适且可以保持一定的硬度,便于调整插入角度,避免误插入翼腭动脉。圆形光滑头端也不易刺破大脑中动脉引起蛛网膜下腔出血。3.3永久粘结颈总动脉近心端近年来学者们对制作MCAO时是否能从颈总动脉分叉置入线栓以及是否需要结扎翼腭动脉意见不一。Koizumi和ZeaLonga认为需要游离结扎颈外动脉远端及其所有分支,由颈外动脉断端插入栓线。基于这种方法主要是考虑到若从颈总动脉分叉出插入线栓就需要结扎颈总动脉近心端,再灌注时完全依靠Willis环由对侧颈总动脉供血,可能引起再灌注不足。由于从颈外动脉插入线栓不易控制方向,如果线栓比较柔软则极有可能误入翼腭动脉造成模型失败。应此需要分离结扎翼腭动脉。本实验永久结扎颈总动脉近心端,线栓由颈总动脉分叉处插入,再灌注完全依靠Willis环。不游离翼腭动脉,而是通过调整插入线栓方向将线栓插入颈内动脉。若线栓误入翼腭动脉,除非已造成颈内动脉的痉挛,一般都可以通过调整角度再次插入。实验中模型组造模时间显著短于对照组,且没有一只死亡。两组大鼠梗死率并无显著差异。研究说明SD大鼠的Willis环解剖结构相对稳定,变异较少,通过Willis环可以达到再灌的目的。因此完全可以通