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文档简介

RT-PCR立RT-PCR技术在鸡新城疫强弱毒株检测中的应用。通过优化RNA抽提、逆转录反应和PCR扩增条件，建立了一种有效的RT-PCR处。最近几年，随着分子生物学技术的发展，RT-PCR技术具有快速、准本文旨在探究利用RT-PCR技术建立新城疫病毒强弱毒株检测方法，RNA纯化试剂盒、逆转录试剂盒、PCR双向引物（强毒株：F5'-TGGCCCACAGCTTATCGCGC-3'，R5'-CGCGTAACCGCGACCCAACT-3'；弱毒株：F5'-CGCCGAGCTCGTCCTTCAAG-3'R5'-CGACGGACCTCAGGGAACTG-3'）RNARNA。在无菌条件下，采用RNA纯化试剂盒提取病毒RNA，按照说明书进行操作。RNAcDNA模板。将反RNA与随机核酸引物（6nt）65℃下混合，退火后加入反转录酶和反转录缓冲液，进行反转录反应。反应条件为：25℃5min，42℃60min，70℃15minPCR设计双向特异性引物，PCR扩增新城疫病毒的基因。按照下列方法进行PCR扩增：（1）PCR反应条件：94℃5min，94℃30s，60℃30s，72℃60s，共35个循环；72℃10min；4℃保存。模板DNA1μL10×Taq缓冲液2.52mMdNTPs混合液2正向引物F（20pmol）1μL反向引物R（20pmol）1μLTaq聚合酶（5U/μL）0.2ddH2O25PCRPCR扩增产物的长度，并将其纯化，RT-PCR通过实验，确定逆转录反应温度、RNAPCR体系的最佳42℃，RNA抽提方法采用纯化试剂盒，PCR体RT-PCRRNA1ng/μLRT-PCR实验结果表明，该方法对新城疫病毒强弱毒株都具有高灵敏度和特异性。R扩增过程中，引物与病毒模板特异性结合，扩增出预期大小的DNA片段（强毒株：460bp；弱毒株：370bp）PCR产物本方法可对不同强度的新城疫病毒进行鉴别。在病毒RNA的初始浓1ng/μL时仍能成功鉴别。实验结果表明，PP10-6时，该方法仍RT-PCR技术是一种快速、准确、高效、灵敏的检测技术，在新城疫RT-PCR进行病原鉴定，可以迅速找到感染源，进行及时隔离和治疗，从而保障家禽养殖业的健康发展。本文采用RNA纯化试剂盒提取病毒RNA，避免了使用有机试剂对环境造成

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