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文档简介
酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂准备将试剂盒及血清样本复温。标准品:1ml标准品稀释液(standarddiluent)重悬标准品(standard),轻微震荡10min,避免形成泡沫,此时,标准品液的浓度为0pg/ml。B:6ml液的浓度为0pg/ml。B:6ml双蒸水将6ml2X分析稀释液A、B稀3.分析稀释液A、释至12ml,稀释后的工作液不能冻存。4.检测试剂A、B:点动离心检测试剂A、B,用分析稀释液A、B分别以1:100将检测试剂A、B稀释成工作浓度。5.洗液:用双蒸水将20ml30X洗液稀释成600ml。注意事项:不要在96孔板里面做梯度稀释实验。实验前15min制备标准品溶液,不要直接在37°C溶解试剂。小心重悬标准品和检测试剂A、B至沉淀完全溶解,避免形成气泡。重悬后的标准品、检测试剂A、B只能使用一次。如果洗液中有沉淀形成,复温至室温,至沉淀完全溶解。建议使用双蒸水来稀释试剂盒样本。实验过程:实验设计:7个标准品孔、1个空白孔。向96孔板的每个孔中加入100ul标准品及样本,贴上封板胶,37°C孵育2h。弃孔中液体,不要洗。每孔中加入100ul检测试剂A的工作液,贴上封板胶,37C孵育1h。弃孔中液体,350ul洗液清洗孔三次,每次1~2min。每孔中加入100ul检测试剂B的工作液,贴上封板胶,37C孵育30min。按照步骤4重复洗板5次。每孔中加入底物溶液90ul,贴上封板胶后,37C避光孵育15~25min(不超过30min),溶液颜色变蓝。每孔中加入50ul终止液,溶液颜色变黄,轻轻拍打板的边缘确保液体混匀。去除板底的液体,立即在酶标仪上450nm检测。注意事项:准备工作:使用合适数量的孔,其余孔于-20C保存。每一步加样时间不要超过10min,加样时轻轻混匀并避免形成泡沫。实验过程中保持孔湿润。
清洗过程中尽量去除所有的液体,尤其在清洗的最后一步。控制反应时间:加入TMB底物后每10min观察颜色变化,避免反应过度。TMB底物溶液容易污染,请避光保存。结果计算:对数作图,横轴为OD值的对数,纵轴为浓度的对数作规程:『ASSATPROCEDURESUMWIAFt¥1Add1DDpLstandardorsampletoeachwell.Incubate2hoursat37°C;Add1DOpLpreparedDetectionReagentA.Incubate1hourai37°C;Aspirateandwash3times;Add100pLpreparedDetectionReagentB.Incubate30minutesat37°CAspiratearidwash5time
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