基因工程-第四章 目的基因的分离与修饰

第四章目的基因的分离与修饰Chapter4PreparationamdModificationsofTargetGene第一节基因的基本结构特征（CharacterofGeneBasicStructure）作为一个具有功能的结构基因应具备下列的元件：转录启动区核糖体识别区编码区（包括起始密码子）开发阅读框终止密码子转录终止区一、原核生物基因的组成（CompositionofprokaryoticGene）1.1基因区：原核生物的基因多数以操纵子（Operon）形式存在，操纵子中的各个基因分别有各自的起始密码子和终止密码子。1.2启动区：包括－35区和－10区1.3SD区：在起始密码子ATG上游约10bp，富含嘌呤的保守区，与16SrRNA结合。1.4转录终止子和终止因子原核生物基因的组成基因区：多以操纵子形式存在，多顺反子mRNA启动区（promoter）：DNA分子可以与RNA聚合酶特异结合的部位，转录开始的部位。SD区：位于AUG上游4~13个NT处的富含嘌呤的序列，为AGGAGG。与16SrRNA的3’端(3’-UCCUCC-5’）,使AUG定位在P位。转录起点-35-10转录终止子(terminator)强终止子，也称为内部终止子。弱终止子，又称为ρ依赖终止子。二、真核生物基因的组成（CompositionofEukaryoticGene）2.1基因区：真核生物的基因含有内含子（Intron）和外显子（Exon）。1.2转录启动区：包括TATA框，CAAT框和GC框1.3Kozak区：

GCCACCATGG

1.4转录终止子真核生物基因的组成基因区：

割裂基因，外显子，内含子转录启动区单顺反子mRNA转录终止子三、其他基因组基因的组成质粒的基因：不含内含子病毒的基因：以多顺反子进行转录；有重叠基因；线粒体的基因：以多顺反子进行转录；无SD序列；叶绿体的基因：以多顺反子进行转录，含有类似于原核基因组的启动子和SD序列四、基因的排列基因组中的基因一个接一个排列在DNA分子上，基因之间存在长度不等的间隔区，但某些生物基因组中的基因存在重叠、重复、加倍和重排等现象。重叠基因重复基因原核生物无重复序列低等真核生物10-20%高等植物80%高等动物50%重复基因加倍基因高等生物含倍性染色体，基因组为多倍。原核生物的单倍，质粒是多拷贝的1目的基因2目的基因的制备3目的基因的分离2目的基因的制备2.1直接分离法2.2基因文库技术分离目的基因2.3基因组文库分离法2.4cDNA基因文库分离2.5PCR技术扩增目的基因2.6化学合成基因2.1直接分离法-限制性内切核酸酶酶切法该法适于从简单基因组中分离目的基因，如质粒和病毒等DNA。BamHI和EcoRI酶切，可获得目的基因。对于高等真核生物而言，基因组DNA十分庞大,基因可达数万个，且基因组成结构复杂，除编码序列，还有非编码序列及调控序列，基因间还存在大量的间隔序列和重复序列，因此，单个目的基因在整个基因组中所占的比例极其微小，除少数例外，绝大多数基因难以直接分离得到。为了解决这个难题，一种可行的方法就是将这个基因扩增，增加成功分离目的基因的可能性。但是由于要分离的目的基因往往是未知基因，因此无法对它进行特异性扩增，只能对所有的基因进行扩增，也就是构建该生物材料的基因文库，然后再根据不同的方法将所需的克隆筛选出来，最后分离得到目的基因。1）概念：基因文库(genelibrary)：指某一生物类型全部基因的集合。以重组体形式出现。基因文库由外源DNA片段、载体和宿主组成。一个理想的基因文库应包括该生物染色体基因组全部遗传信息(即全部DNA序列)。2.2基因文库技术分离目的基因用途：

a）分离有用的目的基因

b）保存某种生物的全部基因2)基因文库构建的基本程序：①DNA提取及片段化，或是cDNA的合成。②载体的选择及制备。③DNA片段或cDNA与载体连接。④重组体转化宿主细胞。⑤转化细胞的筛选。限制性内切酶……克隆、转化、培养、鉴定基因组DNA基因文库基因文库技术分离目的基因----未知基因

基因的克隆：获得含重组DNA的宿主细胞克隆基因的分离:从文库中分离出目的基因分离基因的鉴定:确定基因的结构及功能

3）基因文库的类别基因组文库与cDNA文库基因组文库：指将某生物的全部基因组DNA切割成一定长度的DNA片段克隆到某种载体上而形成的集合。基因组文库分为：核基因组文库、叶绿体基因组文库及线粒体基因组文库。cDNA文库：是指某生物基因组转录的mRNA经反转录形成的cDNA片段与某种载体连接而形成的克隆的集合。cDNA(complementaryDNA，互补DNA)：是由生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内的mRNA经体外反转录后形成的互补DNA。结构基因外显子内含子转录、加工修饰mRNA2目的基因的制备2.1直接分离法2.2基因文库技术分离目的基因2.3基因组文库分离法2.4cDNA基因文库分离2.5PCR技术扩增目的基因2.6化学合成基因2.3.1基因组文库的概念和大小2.3.2λ噬菌体基因组文库的构建2.3.3考斯质粒基因组文库的构建2.3.4YAC基因组文库的构建2.3基因组文库的构建2.3.1基因组文库(Genomiclibrary)的概念和大小概念：基因组文库：某种生物基因组的全部遗传信息通过克隆载体储存于某一受体菌的群体中。基因组DNA文库的类型根据所选用的载体可以分为：质粒文库、噬菌体文库、粘粒文库、人工染色体文库（细菌人工染色体文库、酵母人工染色体文库）。一个理想的基因组文库要有足够多的克隆子数，保证所有的基因都在克隆子群体中。以某生物基因组约3

106kb，酶切片段平均长度15kb。理论克隆数：

基因组DNA总长

DNA片段平均长度

3

106/15=2

105基因组文库的大小实际克隆数：DNA片段是随机克隆的，因此理论值只是基因组文库所需要的最小数值。一个完全的基因文库就必须含有更多的重组体克隆数。

文库理论克隆子数＝以上的例子，N值应是：ｌｎ（１－0.99）ｌｎ[1-（15/3

106

）]

1975年，L.Clark和J.Carbon的经验公式：文库实际克隆子数N＝ｌｎ（１－ｐ）ｌｎ（１－ｆ）N:基因组文库必需的克隆子数；P:文库中目的基因出现的机率，一般情况下期望值99％，即0.99ƒ:分离的DNA片段平均大小与基因组大小的比值。一个完全的基因文库必须含有3-10倍于最低重组体克隆数的克隆。

N==9

1053

106/15=2

105基因组文库应具有的克隆子数基因组DNA文库的质量标准一个理想的基因组DNA文库应具备下列条件：重组克隆的总数不宜过大，以减轻筛选工作的压力载体的装载量最好大于基因的长度，避免基因被分隔克隆克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域，以利克隆排序克隆片段易于从载体分子上完整卸下重组克隆能稳定保存、扩增、筛选2.2.1基因组文库的概念和大小2.2.2λ噬菌体基因组文库的构建2.2.3考斯质粒基因组文库的构建2.2.4YAC基因组文库的构建2.2基因组文库构建连接克隆载体的选择质粒载体可承载15kbDNA片段

载体可承载23kbDNA片段

Cosmid载体可承载45kbDNA片段

YAC文库4000kbBAC文库300kb利用质粒载体构建基因组文库该法简单、快速、易于操作，但仅适合一些低等真核生物和原核生物。1）载体的特点：λ噬菌体是一种温和噬菌体，可保存在大肠杆菌中。承载较大外源DNA，约23kb。有多种限制酶识别位点。

2.2.2构建λ噬菌体基因组文库获得含目的基因的DNA片段与λ噬菌体载体重组重组DNA的包装转化受体菌2）构建λ噬菌体基因组文库的步骤重组克隆的挑选和保存目的基因DNA片段化方法：超声波处理限制性内切酶部分酶切A机械切割法（超声波处理）：优点：可获得较均一的随机片段，缺点：DNA片段呈平末端，片段不能直接用于克隆，需经末端修饰，连上接头后再用限制性内切酶消化产生黏性末端。B限制酶消化：选用四或六核苷酸的限制性内切酶，如：（GATC）Sau3AI或MboI、BamHI(GGATCC)等。优点：直接产生黏性末端，缺点：片段的随机性较差。基因组DNA的不完全酶切确定限制酶用量，改变酶切时间固定酶切时间，改变限制酶的用量载体的结构左臂：编码噬菌体头部和尾部蛋白的基因右臂：复制起始点、转录启动区和其它必须基因左臂和右臂末端的Cos位点中央片段：不含必须基因基因文库

Sau3AI或MboI密度梯度离心或电泳重组DNA分子的包装:

a.λDNA的包装物的制备:

使用的大肠杆菌菌株：

E.coliBHB2688-包装蛋白

E.coliBHB2690-头部蛋白

b.重组λDNA分子的包装过程包装制备物（-70℃）于冰上缓慢融化加入重组λDNA分子边融化边混合边包装离心除去细胞碎片λ颗粒于-70℃保存待用5)基因组文库的保存

包装的λ颗粒感染E.coli

培养分离λ颗粒-70℃保存DNA片段之间的连接具互补黏性末端片段之间的连接具平末端DNA片段之间的连接

DNA片段末端修饰后进行连接

DNA片段加连杆或衔接物后连接回顾（1）具互补黏性末端片段之间的连接基本原理：

DNA连接酶连接具有互补粘性末端DNA片段。回顾（2）具平末端DNA片段之间的连接基本原理：直接用T4DNA连接酶连接.

回顾（3）DNA片段末端修饰后进行连接1)DNA末端同聚物加尾后进行连接回顾2)黏性末端修饰成互补粘端或平末端后进行连接①修平：用核酸酶切除双链DNA分子的突出核苷酸，修平后用T4连接酶作平末端连接。②补平：用Klenow酶将粘端补平，产生平末端或匹配粘端，再用T4连接酶进行连接。回顾3)DNA片段5’端脱磷酸化后连接基本原理：碱性磷酸酶催化去除DNA的5’磷酸根，防止DNA的自身环化或连接形成多聚体。回顾（4）DNA片段加连杆或衔接物后连接

连杆(linker)：指用化学方法合成的一段由10-12个核苷酸组成的、具有一个或数个限制酶识别位点的寡核苷酸片段。回顾DNA衔接物（adaptor）：由化学合成的一端具有某种限制酶的粘性末端而另一端为平末端的双链寡聚核苷酸短片段。回顾2.3.1基因组文库的概念和大小2.3.2λ噬菌体基因组文库的构建2.3.3考斯质粒基因组文库的构建2.3.4YAC基因组文库的构建

2.3基因组文库构建基因文库

Sau3AI或MboI2.3.3构建考斯质粒基因组文库1）特点：优点：具有质粒的性质，可在细菌中保存和大量复制。含有Cosmid位点，可进行体外包装；克隆容量很高，45kb，载体的分子较小，在10kb以下。2）基因组文库的构建过程缺点：筛选困难；重组效率低；文库不易保存。2.3.1基因组文库的概念和大小2.3.2λ噬菌体基因组文库的构建2.3.3考斯质粒基因组文库的构建2.3.4YAC基因组文库的构建

2.3基因组文库构建2.3.4构建YAC基因组文库1）载体的特点：YAC载体的基本组成部分：*自主复制序列(ARS)*着丝粒序列（CEN）*端粒序列（TEL）*选择标记基因*多克隆位点（MCS）优点：承载长达1000kb甚至3000kb的外源DNA片段，2）基因组文库的构建过程2目的基因的制备2.1直接分离法2.2基因文库技术分离目的基因

2.3基因组文库分离法2.4cDNA基因文库分离2.5PCR技术扩增目的基因2.6化学合成基因2.4cDNA基因文库的构建及目的基因分离2.4.1cDNA基因文库的概念cDNA文库：是指某生物基因组转录的mRNA经反转录形成的cDNA片段与某种载体连接而形成的克隆的集合。2.4.2cDNA基因文库的构建2.4.3mRNA丰度与cDNA基因文库大小的关系2.4.4cDNA克隆的优越性2.4.2cDNA基因文库的构建主要步骤：①从生物体或细胞中提取mRNA；②利用逆转录酶合成cDNA的第一条链；③利用DNA聚合酶，以cDNA第一条链作为模板，用适当引物合成cDNA第二条链，④cDNA与载体的重组后导入大肠杆菌宿主细胞增值。mRNA的提取全长mRNA具有一个polyA的3’末端，可以被用于mRNA的分离；用寡聚纤维素柱，选择性地吸附mRNA纯化①分离细胞总RNA，从中分离纯化mRNA；②合成cDNA的第一条链：

a.oligo(dT)引导的DNA合成法：原理：真核mRNA分子具有poly(A)尾巴，加入oligo(dT)短片段，由反转录酶合成cDNA的第一链。缺陷：逆转录酶通常无法到达mRNA分子的5’-末端，必须从3’-末端开始合成cDNA。b.随机引物引导的cDNA合成法：原理：随机引物：人工合成的含有各种可能的排列顺序的六核苷酸片段的混合物，可以与任何核酸片段杂交，并作为聚合酶反应的引物。应用这种混合引物，cDNA的合成从mRNA模板的许多位点同时发生，从而保证得到mRNA的编码区和5’端旁侧。多用于mRNA分子较大且3’端非编码区序列较长；AAAAAAAAAAAA3’

5’3’2.4.2cDNA基因文库的构建主要步骤：①从生物体或细胞中提取mRNA；②利用逆转录酶合成cDNA的第一条链；③利用DNA聚合酶，以cDNA第一条链作为模板，用适当引物合成cDNA第二条链，④cDNA与载体的重组后导入大肠杆菌宿主细胞增值。③合成cDNA第二条链a.自身引导合成法b.大肠杆菌RNaseH酶降解取代法c.oligo(dG)寡聚引物引导法d.PCR法

a.自身引导合成法：原理：单链cDNA的3’端能够形成发夹状的结构作为引物，在大肠杆菌聚合酶I、Klenow或反转录酶的作用下，合成cDNA的第二链。缺点：S1核酸酶切割发夹状结构会丢失对应于mRNA5’端的序列。

S1核酸酶偶尔破坏合成的双链cDNA分子。b.大肠杆菌RNaseH酶降解取代法-置换合成法原理：以第一链合成产物cDNA-mRNA作为切口平移的模板，

RNA酶H对mRNA造成切口和缺口，产生一系列RNA引物，大肠杆菌DNA聚合酶I

的作用下合成cDNA的第二链。优点：a）合成cDNA的效率高

b）直接利用第一链的反应产物，不需纯化

c）避免使用S1核酸酶来切割双链cDNAc.oligo(dG)寡聚引物引导法oligo(dG)作为引物可与cDNA第一链3’末端的poly(T)序列相结合，有效的引发cDNA第二链的合成。d.RCR法

以cDNA的第一条链为模板设计引物。优点：可获得多拷贝的双链cDNA;不用纯化mRNA;同聚物尾巴保护末端.

2.4.2cDNA基因文库的构建主要步骤：①从生物体或细胞中提取mRNA；②利用逆转录酶合成cDNA的第一条链；③利用DNA聚合酶，以cDNA第一条链作为模板，用适当引物合成cDNA第二条链，④cDNA与载体的重组后导入大肠杆菌宿主细胞增值。④cDNA与载体的重组后导入大肠杆菌宿主细胞增值。

cDNA末端的处理由于大片段的平末端连接效率非常低，因此为了避免用平末端与载体连接，对双链cDNA的末端进行加工.方法：添加特异性核酸接头以形成适合于克隆的黏性末端末端转移酶—可以向cDNA末端加上与克隆载体末端互补的尾部2.4cDNA基因文库的构建及目的基因分离2.4.1cDNA基因文库的概念2.4.2cDNA基因文库的构建2.4.3mRNA丰度与cDNA基因文库大小的关系2.4.4cDNA克隆的优越性2.4.3mRNA丰度和cDNA基因文库大小的关系cDNA文库中储存某种基因的概率与总mRNA中这种基因的mRNA的拷贝数有关。某种mRNA的拷贝数越多，意味着cDNA文库中储存该基因的概率越大，越容易分离出来。

某种mRNA在不同组织不同发育时期的丰度不同。

mRNA的丰度与文库克隆子数的关系

N=ln(1-P)/ln(1-f)N:所需克隆数;P:要求的概率;f:一种mRNA的丰度与总mRNA的比值哺乳动物细胞含有10,000-30,000种不同的mRNA分子，某些mRNA分子的拷贝数很低甚至只有一个拷贝。要富集或增大克隆数目来保证构建的文库中能够含有它们的克隆。1)按大小对mRNA进行分级分离通过琼脂糖凝胶电泳分离大小不同的mRNA分子,该方法的分离效果最好，但从凝胶中回收的得率较低.蔗糖梯度离心：分离不同分子量的mRNA.2)cDNA的分级分离*mRNA通过反转录形成cDNA，在插入到克隆载体前，通过琼脂糖凝胶电泳，将不同大小的cDNA分子分离开来。*优点：

a）避免了分离过程中mRNA被污染的RNA酶降解

b）增加了获得全长cDNA克隆的概率

c）获得更准确的分级分离效果（分子量）3）多聚核糖体免疫学纯化法使用抗体纯化合成目的多肽的多聚核糖体。将正在合成的新生多肽链的多聚核糖体结合到免疫亲和柱上，随后用EDTA将多聚核糖体解离下来，并通过Oligo(dT)层析分离mRNA,利用该方法可将目的mRNA纯化数千倍。2.4cDNA基因文库的构建及目的基因分离2.4.1cDNA基因文库的概念2.4.2cDNA基因文库的构建2.4.3mRNA丰度与cDNA基因文库大小的关系2.4.4cDNA克隆的优越性2.4.4cDNA克隆的优越性①cDNA文库以mRNA为材料，特别适用于某些RNA病毒等的基因组结构研究及有关基因的克隆分离。②cDNA文库的筛选比较简单易行。③每一个cDNA文库都含有一种mRNA序列，这样在目的基因的选择中出现假阳性的概率就会比较低，因此阳性杂交信号一般都是有意义的，由此选择出来的阳性克隆将会含有目的基因。④cDNA文库可用于在细菌中能进行表达的基因的克隆，直接应用于基因工程操作。⑤cDNA克隆还可用于真核细胞mRNA的结构和功能研究。局限性：1）cDNA文库包含的遗传信息比基因组文库的少，且受细胞来源或发育时期的影响。2）不能直接获得基因的内含子序列和基因编码区外大量的调控序列的结构与功能方面的信息。3）分离到的多为高丰度mRNA的产物。2目的基因的制备2.1直接分离法2.2基因文库技术分离目的基因

2.3基因组文库分离法2.4cDNA基因文库分离2.5PCR技术扩增目的基因2.6化学合成基因PCR，PolymeraseChainReaction

（1）反应体系：含有目的基因或序列的DNA模板热稳定的DNA聚合酶（Taq酶）一对脱氧寡核苷酸引物（primer）4种脱氧核苷三磷酸(dNTP)Buffer及Mg2+等5

Primer15

Primer2Cycle2Cycle15

5

5

5

5

5

TemplateDNA5

5

5

5

5

5

5

5

（2）基本工作原理Cycle35

5

5

5

5

5

5

5

5

5

5

5

5

5

5

5

25～30次循环后，模板DNA的含量可以扩大100万倍以上。（3）PCR的基本反应步骤变性95˚C延伸72˚C退火Tm-5˚C如果知道目的基因的全序列或其两侧的序列，可以合成一对与模板DNA互补的引物，利用PCR技术扩增出含目的基因的DNA片段。2.5利用PCR扩增目的基因局限性：必须知道侧接靶序列的核苷酸序列，以制备引物。常规PCR扩增片段一般在lkb以内。未知序列的目的基因和大片段基因的扩增，则需要特殊类型的PCR

：套式PCR、反向PCR、不对称PCR、多重PCR、锚定PCR、长程PCR、反转录PCR、荧光定量PCR和原位PCR等。1）Nestedpcr （套式PCR）特点:

需要设计两对引物，一对引物扩增稍长片段，在这一扩增范围内再设计一对引物，扩增的产物是以第一对引物的产物为模版套式PCR

通过内外引物进行两次扩增，大大提高了检测的敏感性2）反向PCR（InversePCR）基本原理：扩增一段已知序列旁侧的DNA，在引物外侧合成DNA。已知序列未知序列未知序列连接酶3）不对称PCR

目的：扩增产生特异长度的单链DNA。方法：采用两种不同浓度的引物，最佳比例一般是0.01∶0.5μM。

高浓度引物低浓度引物以其中的mRNA作为模板，以Oligo（dT）或随机引物或基因特异性为引物，利用逆转录酶反转录成cDNA。以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达

4）RT-PCR:提取组织或细胞中的总RNA5）多重PCR：在一个反应体系中使用一对以上引物的PCR称，其结果是产生多个PCR产物，用于检测特定基因序列的存在或缺失。电泳引物6）原位PCR原位杂交PCR首先将样品组织切片或细胞涂片，然后固定在载玻片上；适当预处理后，将细胞核内的DNA加热变性形成两条单链DNA。针对待检测的选定序列设计一对引物，直接将引物dNTP缓冲液及TaqDNA聚合酶加到载玻片上在原位聚合酶仪内进行PCR扩增反应完毕后将PCR产物固定在载玻片上用相应的检测信号系统进行检测。可以检测组织细胞中微量DNA或RNA，且可精确定位人类染色体端粒DNA的荧光原位杂交照片7）定量PCR：荧光实时定量PCR技术是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。常用的荧光标记方法：非特异检测——双链DNA内插式荧光染料；代表是SYBRGreenI荧光染料扩增序列专一检测——主要指TaqMan荧光探针荧光染料技术成本低廉，实验设计简便；而探针杂交技术在原理上严格，所得数据特异性高、更为精确SYBRGreenI工作原理：

SYBRGreen1

染料只有和双链DNA结合后才发荧光。单链DNA、变性DNA:无荧光信号GTTTGGCCCCCCCAAAGGGACTTGATAGCATCGTAATaqMan探针法： 指PCR扩增时在加入一对引物的同时另外加入一个特异性的荧光探针：该探针只与模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间。探针的5′端标记有荧光报告基团(Reporter,R)，3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher,Q。当探针完整的时候，5′端报告基团经仪器光源激发的荧光正好被近距离的3′端荧光基团淬灭，仪器检测不到5′端报告基团所激发的荧光信号与目标序列互补

PCR扩增过程中：Taq酶在链延伸时遇到与模板结合的探针，其5′-3′外切酶活性（此活性是双链特异性的，游离的单链探针不受影响）就会将切割探针释放5′端报告基团游离于反应体系中，远离3′端荧光淬灭基团的屏蔽，5′端报告基团受激发所发射的荧光信号就可以被探头检测到。每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。报告信号的强度就代表了模板DNA的拷贝数2目的基因的制备2.1直接分离法2.2基因文库技术分离目的基因

2.3基因组文库分离法2.4cDNA基因文库分离2.5PCR技术扩增目的基因2.6化学合成基因2.6化学合成法获取目的基因由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列基因的化学合成20世纪70年代，Khorana提出，

提出体外扩增DNA1922-）印度-美国化学家遗传密码的破译，获得1968年诺贝尔医学和生理学奖。DNA合成仪的基本工作原理是：将要合成的DNA片段3’端的第一个核苷酸固定于不溶性载体上．该核苷酸开始与另一核苷酸进行缩合反应，形成二核苷酸分子通过酸或碱洗脱其一端的保护基团，再次与另一个5’或3’保护的核苷酸分子进行第二次缩合反应，形成三核苷酸分子；再用同样的步骤与下一个核苷酸进行循环反应。每循环反应一次就接长一个核苷酸，一般一个循环只需几分钟。接长的链始终被固定在不溶的固相载体上，合成结束后，将寡核苷酸链从固相载体上洗脱下来。化学合成法优缺点优点：准确性极高，合成速度较快缺点：合成的寡核苷酸链长度短(不大于80个碱基)一般用于PCR引物、寡核苷酸探针、人工接头、较小基因的合成。对于超过该法合成范围的寡核苷酸链的合成，可采用分段合成法，再连接组装成完整的基因。图1基因合成的全片段酶促连接法图2基因合成的酶促填充法2目的基因的制备直接分离法基因文库技术分离目的基因基因组文库分离法

cDNA基因文库分离

PCR技术扩增目的基因化学合成基因基因文库和cDNA文库的建立组织可克隆之DNA载体DNAcDNAmRNA部分或完全酶解DNADNA长度分级甲基化，双链接头DNADNA与载体连接引入大肠杆菌鉴定文库的克隆数和特性扩增后供长期储存筛选出所需要的克隆从中分离出目的基因基因文库技术分离目的基因

基因的克隆：获得含重组DNA的宿主细胞克隆基因的分离:从文库中分离出目的基因分离基因的鉴定:

确定基因的结构及功能

测序自动测序仪功能分析预测软件1目的基因2目的基因的制备3目的基因的分离基因文库的筛选和基因分离：在成千上万的克隆中仅极少数含目的基因，且大多数基因的产物不具有可选择的表型特征，如何筛选？：(1)用特异探针进行分子杂交；(2)用免疫和生化方法来检测基因产物；(3)用特异性引物进行PCR扩增。杂交：亲缘关系很近的不同来源的DNA单链或RNA单链与DNA单链之间通过碱基互补形成杂交分子的过程。分子杂交分子探针标记核酸分子探针：用同位素、生物素或荧光染料标记一小段已知核苷酸序列作为探针，探针的序列如果与DNA或RNA序列互补，就可以探知核酸分子。粗线表示分子探针检测方法：同位素标记、荧光标记、颜色标记平板杂交/菌落杂交技术3目的基因的分离3.1编码产物已知的目的基因3.2编码产物未知的目的基因3目的基因的分离3.1编码产物已知的目的基因根据特异蛋白分离目的基因氨基酸顺序反推核苷酸序列蛋白免疫反应功能互补法分离基因根据已知基因序列或同源基因序列分离目的基因3.2编码产物未知的目的基因3.1已知编码产物的目的基因分离3.1.1根据特异蛋白分离目的基因功能克隆法：依赖于基因表达产物及其生物功能进行基因克隆。①分析特异蛋白质中氨基酸顺序，合成寡核苷酸探针，从文库中分离出相应基因。如：Leu-Val-Phe-His-Asp-Ala六肽

对应mRNAQUN-GUN-UUQ-CAQ-GAQ-GCNN=ACGT/U探针序列

CAN-AAP-GTP-CTP-CGQ=CT/UP=AG32种14聚体混合物，其中必有一种14聚体与待测DNA完全互补利用这种方法首次人工合成了胰岛素基因。虽然在早期采用这种方式已经成功地克隆了许多基因。局限性：兼并密码子效率低未知基因及产物②制备特定的蛋白质抗体及蛋白质功能检测，筛选相应的基因。待分离基因的表达产物—蛋白质纯化和制备出相应抗体。再用特异的蛋白质抗体筛选含有目的基因的cDNA表达文库，分离含目的基因的克隆。局限性：特异蛋白必须是已知且分离纯化的。将菌落或噬菌斑原位复制到膜上处理之后蛋白质暴露，与第一抗体温育漂洗未结合的抗体，加入经标记的第二抗体能与第一抗体结合3.1.2功能互补法分离基因基本原理：利用被克隆的DNA片段与寄主细胞的染色体DNA在功能上有同源互补性来分离基因。例如：营养缺陷型互补基因。实例：基因组文库DNA→

转化酿酒酵母细胞（leu2,Leu-）→转化细胞（leu2/LEU2，Leu+）→LEU2基因Leu2(基因型),Leu-（表型）营养缺陷型特点：在选择培养基（一般为基本培养基）上不生长3.1.3根据已知基因序列或同源基因序列分离目的基因基本原理：从DNA序列数据库（Genbank

等）中查找有关基因的序列，以此为核酸探针进行杂交筛选。对杂交后的阳性克隆子重组DNA进行测序，与已知基因的核苷酸序列进行比较和鉴定，确定是否是待分离的目的基因。举例：菠菜的基因组中寻找耐受重金属基因对应mRNAAUC-GUG-UUA-CAU-GAA-GCA

（拟南芥/水稻的Genbank

）探针序列

TAG-CAC-AAT-GTA-CTT-CGT

缺陷：分离的基因一般不是新的基因。3目的基因的分离3.1编码产物已知的目的基因根据特异蛋白分离目的基因氨基酸顺序反推核苷酸序列蛋白免疫反应功能互补法分离基因根据已知基因序列或同源基因序列分离目的基因3.2编码产物未知的目的基因3.2编码产物未知的基因分离采用特殊手段获得探针，再从文库中分离；差别杂交(differentialhybridization)，减法杂交（subtractivehybridization）DNA标签法，也叫DNA插入诱导法mRNA差别显示技术,DD-PCR酵母双杂交系统染色体步查法3.2.1差别杂交法基本原理：利用两组细胞mRNA种类的差异，分离克隆差异mRNA所对应的cDNA，用于分离克隆新基因；分别制备两种细胞群体的mRNA提取物，以这两种总mRNA（或其cDNA)，分别筛选由表达目的基因的细胞群体构建的cDNA文库。举例：分离受生长因子调节的基因1）构建的cDNA文库涂铺在平板上2）一式两份转至膜上。3）用血清刺激的和未刺激的细胞的po1y(A)RNA，经反转录制备放射性标记的总cDNA探针4）分别与已转移噬菌体DNA的膜杂交5）通过对杂交结果的仔细对比分析，可以找到那些仅与血清刺激细胞总cDNA探针杂交的或杂交信号明显强烈的克隆，它们代表了血清诱导表达的mRNA。根据目的基因特异性表达进行分离：有的基因只有在某生物的一定的生长发育阶段或一定的器官中才能表达。例如，待分离的目的基因只有在植物的根中才能有效表达，而在其他器官中(如植物的叶)不能表达。因此用根构建的cDNA文库中含有携带目的基因cDNA的克隆子，而用叶构建的cDNA文库中不含携带目的基因cDNA的克隆子。根据这一性质以根和叶的总mRNA(或它们的cDNA)为探针，分别对两种cDNA文库进行杂交比较(图)。用根的总mRNA(或它们的cDNA)制备的探针对这两个cDNA文库进行杂交时，所有克隆子都呈阳性反应；而用叶的总mRNA(或它们的cDNA)制备的探针进行杂交时，叶cDNA文库中的所有克隆子都呈阳性反应，根cDNA文库中的某些克隆子呈阴性反应。最后比较4份杂交结果，便可以在根cDNA文库转膜的大量菌落中挑选出含目的基因的菌落。分离特定组织中表达的基因差示杂交法的特点：不需要知道目的基因的序列特别适用于分离在特定组织中表达的基因特定发育阶段表达的基因受生长因子调节的基因或者分离经特殊处理而被诱发表达的基因。差示杂交法的局限1）反应灵敏性不够高，不适用于低丰度的mRNA的目的基因。2）需要筛选大量的杂交滤膜，鉴定大量噬菌斑，十分费时耗力；3）重复性差。3.2.2减法杂交基本原理：尽量消除两种样品共同存在的基因序列，从而有效富集目的基因序列，提高基因筛选分离的敏感性。1）mRNA减法杂交从表达目的基因的组织提取mRNA并反转录为cDNA，再与无目的基因表达的组织提取的mRNA做过量杂交，两者均表达的基因产物将形成cDNA/mRNA杂交分子，而特异mRNA反转录的cDNA仍单链，将其分离即为差异表达序列。图用递减文库和探针分离T细胞受体基因从T细胞提取RNA假定编码T细胞受体的基因仅在T细胞中表达而在B细胞中不表达用从T细胞制备的单链cDNA与过量的B细胞poly(A)RNA杂交，在这两种类型细胞中均表达的分子将以cDNA-RNA的形式发生杂交，那些仅在T细胞中表达的cDNA分子(约占总mRNA的2％)仍以游离的单链形式存在。从B细胞制备RNA用羟磷灰石柱分离这种杂交混合物，在一定洗脱条件下，DNA-RNA杂交双链分子结合在柱上，单链cDNA则从柱中流出。回收这些T细胞特异的单链cDNA分子并把它们转变成双链，再克隆至λ噬菌体载体中，产生一个约含5000个克隆的递减文库。2）基因组DNA减法杂交可以用来分离缺失突变基因。3.2.3mRNA差别显示技术mRNAdifferentialdisplaybyRCR,DD-PCR基因的差异表达：在生物个体发育不同阶段，或不同的组织与细胞中或不同环境下，基因表达差异。即不同基因有序的时空表达方式。差异显示PCR(DD-PCR)：通过对特定组织类型的总mRNA进行PCR扩增、电泳，并找出待测组织和对照之间的特异扩增条带。差异显示PCR(DD-PCR）的引物:3’-端锚定引物，5’-T11MN或5’-T12MN通式表示。其中M为除了T以外的任何一种核苷酸（即A、G或C），而N则为任何一种核苷酸（即A、G、C或T），故MN共有12种不同的排列组合方式。5’端随机引物：10个核苷酸长度，20种全部的240组引物，以反转录第一链为模板进行PCR扩增，可以得到20000条DNA带，基本涵盖了一定发育阶段某种类型细胞所表达的全部mRMA。DD－PCR切割差异条带，回收cDNA制备探针在基因文库中筛选，获得该差异片段对应的全长cDNA或者完整基