基因工程与基因组学-2

第11章基因工程和基因组学第一节基因工程基因工程概念：广义：包括细胞工程、染色体工程、细胞器工程等狭义：基因工程一、基因工程概述20世纪70年代初，DNA重组技术的发展而产生1971,美国Smith,H.O.

细菌限制性酶，酶切病毒DNA分子——DNA重组时代的开始1972,Berg,P.

猿猴病毒DNA

λ噬菌体

DNA1973，Cohen,S

酶切后的外源DNA分子+质粒诞生：分离限制性酶新的DNA分子重组DNA分子1982，美国食品既药物管理局批准，首例基因工程产品进入市场——细菌中表达人胰岛素1985，转基因植物获得成功1996，克隆羊诞生基因工程——改造，创建生命形态；生产药品、疫苗、牛奶和食品；诊断和治疗遗传疾病；成为当今人类社会日常生活的组成部分。应用：DNA重组——创造自然界没有的DNA分子新组合

分子生物学、核酸化学、微生物遗传学的现代方法和手段——综合技术包括：1.从细胞和组织中分离DNA2.识别特异DNA序列的限制性内切核酸酶酶切DNA分子，制备DNA3.DNA片断+载体重组DNA分子4.重组DNA分子宿主细胞产生多个相同的拷贝，克隆clone5.重组DNA分子通过细胞分裂分配到子细胞中6.从宿主细胞中回收、纯化、分析克隆的重组DNA分子7.克隆的DNA能转录成mRNA、翻译蛋白质。能分离、鉴定基因产物宿主细胞中自我复制二、限制性内切核酸酶基因工程的工具、基石功能：识别双链DNA分子中一段特异的核苷酸序列，切断双链的DNA。降解细菌中外来的DNA分子,限制、阻止细菌的侵染。已经分离出200多种限制性内切核酸酶，可分两类每隔一段DNA序列随机切割双链DNA分子（无序列特异性）准确识别双链DNA特异序列（基因工程中广泛应用）

双链中，识别的序列是对称的：回纹对称序列（palindrome）双链DNA被切割后产生两个相同的单链粘性末端（stikyend）EcoRⅠ

两种片断放在一起，适宜条件下，通过碱基互补——双链DNA分子（通过氢键）DNA连接酶，形成磷酸二脂键，连接成重组的DNA分子切割后产生平齐单链粘性末端SmaⅠ切割后产生平齐末端，DNA连接酶，连接成重组的DNA分子酶切重组的DNA分子部分常用的限制性酶作用：经过酶切的DNA片断，只有和适合的载体（vecter）DNA连接构成重组DNA分子，通过载体进入宿主细胞（hostcell），在宿主细胞中复制、扩增、克隆出多个拷贝。可作为DNA载体的有：质粒、噬菌体、病毒、细菌、酵母人工染色体BAC、HAC等三、载体作为载体的DNA分子需具备的条件：具有复制原点（ori）,在宿主细胞中独立自我复制，携带的外源DNA片断一起复制。多克隆位点（multiplecloningsite,MCS或polylinkerregion),具有多种限制性酶切的切点，每种酶切的切点只有一个，切点不在复制原点、抗生素选择标记基因内。有选择标记（至少一个），抗生素、某种酶，而宿主中没有这种基因容易从宿主细胞中回收。1.细菌质粒独立于细菌染色体而自然存在，自我复制、容易分离和导入，环状双链DNA分子。用于克隆分子量<10kb的外源DNA片断，应用范围广，拷贝数多。1000个1个复制后宿主细胞宿主细胞转化时重组型检测标记在DNA克隆中根据宿主表型质粒是否带外源DNA片断Puc18

分子量小（接受较大片断）、拷贝数多（500）、多克隆酶切位点（克隆方便）、α-互补显色表型（检测标记）

菌落成蓝色阳性克隆携带外源DNA没有外源DNA全长49kb可接受15-23kb外源DNA片断2.λ噬菌体2/3的序列为中间基因族DNA左臂DNA右臂可以被外源DNA片断取代不影响噬菌体感染细菌、形成噬菌斑（centralgenecluster）导入限制性酶切点导入限制性酶切点DNA右臂DNA左臂DNA左臂可以被外源DNA片断取代DNA右臂噬菌体蛋白包装提取物转导感染宿主菌株在宿主细胞内繁殖、扩增噬菌斑鉴定阳性克隆特点：克隆载体，表达载体用作cDNA、核DNA的克隆载体基因库的筛选中，λ噬菌体作载体与细菌质粒相比，容易操作、阳性克隆数多，用于各类基因库的构建3.柯斯质粒柯斯质粒(cosmid):部分λ噬菌体DNA与部分细菌质粒DNA序列组建而成。组成（λ噬菌体的cos序列12bp、细菌质粒的复制原点）：cos序列：噬菌体DNA包装成噬菌体时所必需的质粒的复制原点：柯斯质粒在细菌细胞中同普通细菌质粒一样进行自主复制抗生素抗性基因能在两种不同的生物中复制的载体既能在原核生物（如大肠杆菌），又能在真核生物（如酵母）中复制的载体。特点：细菌质粒的复制原点、选择标记基因真核生物自主复制序列（autonomouslyreplicatingsequence）、选择标记性状应用：在细菌中用于克隆、扩增克隆的基因在酵母菌中用于基因表达分析种类：YEp系列载体、YIp、YCp、YRp系列载体4.穿梭载体（shuttlevecter）YEp

(yeastepisomalplasmid)：酵母菌附加体质粒YEp

酵母菌附加体质粒，其自主复制序列来自于酵母菌的内源附加体2μ，使每个细胞的拷贝数保持在100个左右。两个顺式调控元件：在细胞分裂中，使细胞分配到的质粒数相近。抗生素:Amp和Tc抗性及URA3(尿嘧啶)基因用于在酵母菌中选择。两个抗性基因序列内，有可供克隆外源DNA片断的酶切的位点外源基因插入失活转化URA3-

酵母菌选择阳性克隆5.细菌人工染色体

（Bacterialartificialchromsome,BAC）很多真核生物基因长度在50kb以上，前述载体不能携带大于50kb的外源基因片断。设计构建细菌人工染色体(Bacterialartificialchromsome,BAC)。

克隆100kb以上的DNA片断带有外源基因片断的BAC载体，在细菌细胞中，通常是单拷贝——保持DNA大分子，在细胞内稳定复制，不发生重组。前述载体不能携带大于50kb的外源基因片断。基因工程改良BAC载体F因子6.酵母菌人工染色体

(Yeastartificalchromsome,YAC)适应真核生物基因组分析，自主复制，可在细菌、酵母菌中选择的标记，克隆位点，100-1000kb的外源DNA片断人类基因组计划、图位克隆分离基因的重要工具，促进人类人工染色体（humanartificalchromsome,HAC）的研究7.Ti质粒及其衍生载体利用基因工程技术改良植物性状，需要将重组DNA运载到植物细胞并使之表达。Ti质粒衍生载体是最早成功的植物载体。特点：细菌质粒，自然存在于一种根瘤土壤杆菌（革兰氏阴性菌）（Agrobacteriumtumefaciens）细胞中根瘤土壤杆菌侵染与转基因大多数双子叶植物产生冠瘿瘤独立不受控制生长Ti质粒：诱导瘤细胞根瘤土壤杆菌感染受伤部位冠瘿碱碳源氮源T-DNA整合宿主细胞染色体Ti质粒的特点5个主要功能区：T-DNA：质粒转移冠瘿碱代谢复制原点毒性区

200-500克kb，环状DNA分子很难用作DNA克隆载体进行操作的毒性基因是T-DNA转移所必需的，以顺反两种方式调控T-DNA的转移致瘤基因，与转移无关诱导根瘤细胞根瘤细胞不能再生植株T-DNA卸甲抗性基因、外源基因重组T-DNALB++RB转移、整合植物染色体再生转基因植株直接参与转移、整合LB,RB:T-DNA:Vir区Ti质粒的衍生载体用于植物基因工程的两套载体双元载体（binaryvector）两个质粒：1一个质粒，克隆外源基因片断的克隆质粒：在大肠杆菌、根瘤土壤杆菌中复制，可在两者之间转移，也是一种穿梭质粒。2另一个质粒，以与pBin19匹配使用的pAL4404为例（pAL4404为非致病Ti质粒）没有T-DNA，只有Ti质粒的毒性区，以反式调控的方式调控转所质粒上的T-DNA的转移。3两个质粒分别导入根瘤土壤根菌后，经根瘤土壤杆菌介导，克隆质粒中的T-DNA转移到植物基因组中。共整合载体包括两个质粒：一个用于克隆外源基因，如pMON200

另一个带有毒性基因，如pTIB6S3-SE两个质粒有一段同源序列，在根瘤土壤杆菌中经过重组整合成一个载体，称共整合载体另外：还有一类用于植物基因工程的载体，不经根瘤土壤杆菌介导，在物理及化学方法的作用下，将外源基因导入植物细胞，整合导植物基因组中。它与穿梭质粒的结构特点类似。如：pAHC25主要用于单子叶植物。一个基因是编码一条多肽链的一个DNA片断，包括启动子、终止子及内含子。基因的分离与鉴定是DNA重组的关键步骤之一。分离的基因可用于分析基因序列、结构与表达，为基因工程提供目的基因。四、基因的分离与鉴定（1）构建基因库（library）基因库（library）是一组DNA和cDNA序列克隆的集合体。从基因库中分离基因首先要构建基因库。基因库可分为：核基因库、染色体库、cDNA库、线粒体库等1.从基因库中分离基因核基因库（genomiclibrary/bank）将某一生物的全部基因组DNA酶切后与载体连接构建而成的全部DNA+=酶切核基因库感染寄主细胞感染寄主细胞感染寄主细胞感染寄主细胞感染寄主细胞感染寄主细胞感染寄主细胞染色体基因库

将