小鼠肝脏的解剖及肝切除术的实验研究

小鼠肝脏的解剖及肝切除术的实验研究

在从牙齿上切除肝脏后，它具有强大的再生能力，通常为7.10天。1931年Higgins和Anderson首次创建大鼠70%肝部分切除模型,随后这一模型被广泛应用于肝再生、肝肿瘤、肝衰竭、肝脏移植等相关基础研究。随着减体积肝移植、活体肝移植、双或多供体肝移植、肝段移植等新技术正越来越多地应用于临床,基础研究不仅对肝部分切除模型的制作提出了更高的要求,而且模型动物也越来越多样化。已有报道在转基因和基因敲除小鼠中建立肝再生模型,使肝再生的分子生物学机制研究获得了突破性进展。然而,众多学者直接将大鼠70%的肝部分切除技术运用于小鼠中,造成不同实验室之间较大的结果差异。由于大、小鼠肝脏结构的分叶特性,小鼠的肝脏解剖及肝叶比例是否完全等同于大鼠目前并无相关研究证实。本实验对60只成年C57BL/6J小鼠肝脏进行解剖学观测并施行常用的70%和90%肝部分切除术,旨在为小鼠肝切除模型的建立提供解剖基础和实验依据,为基于此模型的相关研究提供理论依据。材料和方法一、饲养环境及电子外科健康成年C57BL/6J小鼠60只(中山大学动物实验中心提供),年龄11~12周,体质量25~28g,雌雄各半,随机分为A组、B组和C组,各20只,雌雄分笼饲养于无特定病原体环境(SPF级)中,温度控制在(22.0±2.0)℃,自由进水,标准鼠食喂养,12h昼夜生活环境。显微外科手术器械1套(可反复高压消毒),自制泡沫塑料鼠板1个,腹腔小拉钩3个,电子称及电子天平(精确到0.0001g)各1个。各组手术操作均在SPF级环境中完成。二、不同肝叶比例的调查1.A组计算小鼠70%和90%的肝叶比例:取A组小鼠,术前不禁食、水,于手术当日早晨8时分别称取体质量并记录,3%水合氯醛按1.2ml/100g腹腔注射麻醉,麻醉满意后将其固定在自制泡沫鼠板上,取腹正中切口,安尔碘消毒3遍,切口长约2cm,打开腹腔,用自制腹腔小拉钩分别拉开左、右腹壁及向上拉开剑突,用棉签浸湿生理盐水后轻柔搏动肝脏,显微剪游离肝周韧带,快速切取整个肝脏,剔除肝表面外侧的肝静脉及肝上、肝后下腔静脉和肝实质外侧的胆管、门静脉、肝动脉及结缔组织。用电子天平称其湿重(体质量),计算全肝(湿重)/体质量比;分别称量左外叶、中叶、右前叶、右后叶和尾状叶体质量,计算70%和90%的肝叶比例,为下一步手术提供依据。2.B组70%肝叶切除术:取B组小鼠,开腹同前,根据先前计算结果,先用1-0手术丝线集束结扎左外侧叶肝蒂,切除左外侧叶(图1所示第1步);然后依法结扎肝中叶肝蒂并切除(图1所示第2步)。3.C组90%肝叶切除术:C组小鼠在70%肝叶切除的基础上,继续结扎并切除肝右叶(图1所示第3步)。B、C组用湿棉签清除腹腔内积液,确认无活动性出血后用1-0手术丝线分两层关腹。术后常规饲养,观察存活情况,记录两组手术成功率及术后1周动物生存率。三、体质量或质量生存率应用SPSS16.0统计软件分析结果,体质量(或质量)以ue003±s表示,生存率(%)=存活数/总数×100%。一、肝湿重、体质量及全肝质量比小鼠肝脏分叶结构明显,依据小鼠各叶独立的脉管系统,并参照人体肝脏分叶及命名方法,直观、简洁地将其分为5叶:左外侧叶、中叶、右前叶、右后叶、尾状叶(图2),胆囊位于肝中叶。肝脏颜色红润,质地柔软,无明显结节及脂肪样变。每个肝叶有相对独立的脉管系统,其中右前及右后叶有一段融合共用的脉管系统。根据对20只成年C57BL/6J小鼠肝脏测量的结果,小鼠全肝湿重(质量)为(1.325±0.029)g,体质量为(26.500±1.140)g,全肝质量/体质量比为(4.92±0.13)%,肝左外侧叶与中叶之和约占全肝比重的70%;左外侧叶、中叶、右前叶与右后叶之和约占全肝比重的90%。每叶肝脏质量及所占全肝比例见表1。二、术后手术成功率在预实验基础上,B组小鼠完成70%肝脏部分切除的时间为(18.2±1.1)min,C组小鼠完成90%肝脏切除的时间为(26.7±1.5)min。本实验术中无结扎线脱落所致下腔静脉、门静脉或肝动脉出血,无胆瘘等。手术成功率为100%。B组和C组术后数小时内均出现萎靡不振、毛发竖立,嗜睡状态,5~10h后恢复活动,可自由进食、饮水。B组术后1周内动物存活率为100%;C组术后1d内的生存率为30%(6/20),2d存活率为0。C组死亡动物尸体解剖时腹腔内未发现有血凝块、脓肿、肠瘘等。不同类型肝叶切除的效果分析小鼠和大鼠的肝脏解剖结构不同之处在于小鼠肝脏有胆囊,大鼠则无该器官;相同之处为小鼠肝脏各叶同样具有相对独立的Glisson系统和肝静脉系统,小鼠肝脏分为4个解剖功能单位:左外侧叶、中叶、右叶(包括右前叶和右后叶)和尾状叶。从A组小鼠肝脏的测量结果来看,各肝叶形态、大小比例相对恒定,使得单独切除其中1个或数个肝脏功能单位变得简单可行,而且切除肝叶比重相对恒定,保证了模型的规范性及有效性。肝切除对肝再生的刺激强度与所切除肝脏的质量有直接的关系,70%和90%肝切除模型是实验中常用的两种基础模型。本组实验结果显示,小鼠肝左外侧叶与中叶之和约占全肝比重的70%(残肝为右叶和尾状叶);左外侧叶、中叶、右前叶与右后叶之和约占90%(残肝为尾状叶),这一结果表明大、小鼠70%和90%肝切除的肝叶数目基本一致。理论上,如果切除左外侧叶、中叶、右前叶及右后叶,只保留尾状叶,那么残肝质量仅为全肝的7%左右;如选择保留右前叶,残肝质量更接近于全肝的10%。但是,由于右前叶与右后叶同属一个功能单位,两者有一段融合共用的脉管系统,单独切除右后叶容易损伤残留右前叶的脉管系统的通畅性,势必会影响术后肝功能的恢复,导致相关实验结果产生偏差,从而降低模型的有效性。我们体会,建立90%肝叶切除模型时,采取保留完整的尾状叶更利于术后残肝发挥功能。另一方面,本组模型所采用的直视下分步单纯丝线结扎肝脏解剖功能单位后再切除肝叶的方法,不仅术中出血量极少,甚至无出血,而且与显微镜下肝部分切除术相比,更具有操作简单,易于完成以及效率高等优点。值得注意的是,切除肝中叶时,丝线结扎位置应距离肝上下腔静脉2~3mm远为宜,以保障术后下腔静脉不会发生狭窄。此外,建模后如需计算再生肝脏质量与体质量比,应剔除切肝时剩余肝叶残桩部分肝组织后再计算。本组90%肝叶切除术后2d无动物存活,这与Gaub等所报道的大鼠90%肝叶切除后的生存率基本一致,但本组小鼠90%肝叶切除术后24h内尚有30%的存活率,这为研究急性肝衰竭早期病理生理变化和治疗提供了一个重要的窗口期。关于动物年龄、性别、术前禁食、手术时间、麻醉等实验相关问题,C57BL/6J作为动物实验中最常用的小鼠品系之一,选其作为模型动物,实验结果更具有参考价值。研究表明肝部分切除后肝再生过程中,幼年动物(4~6周)肝再生的速度比成年动物快,相反,40周以上的动物肝再生的速度明显滞后。因此,肝再生模型宜选用8~14周龄的小鼠。同时尽可能使用同性别小鼠,因为某些遗传基因的改变可能产生性别依赖的结果。很多研究者建立动物肝部分切除模型时,常对实验动物施行术前数小时的禁食、禁饮,事实上,禁食容易导致肝细胞脂肪样变,极易影响术后的肝再生,长时间的禁饮可致小鼠体质量明显下降,导致实验结果误差增大。此外,肝脏代谢会随着昼夜节律而改变,上午时段完成肝切除模型更可取。麻醉在完成动物模型中占有重要作用,麻醉剂选择和使用不当容易导致动物死亡,单用气体麻醉剂需要特殊的辅助呼吸装置,增加了实验难度,本研究中使用的水合氯醛及用法用量,不仅操作简单,而且术中麻醉稳定,术后苏醒快,并不明显增加动物死亡率,可作为此类手术的常规麻醉方法。总之,我们采用直视下分步单纯丝线结扎肝脏解剖功能单位后再切除肝叶的方法建立小鼠70%和90%肝部分切