大鼠肝脏细胞离体培养的初步研究

大鼠肝脏细胞离体培养的初步研究

激素（gh）是指含有193个氨基酸的图形激素。脉冲分泌，调节下肢激素、生长素、脑、脑膜、胰岛和胃的激素。它可以促进蛋白质和沉积物的合成和积累，加速脂肪的分解，促进骨细胞的分泌，调节糖的代谢。研究者们最初从猪脑垂体组织中提取生长激素并加以利用,但受生长激素分泌周期、分泌量及纯化工艺等各种复杂因素的影响,收效甚微。随着分子生物学的进一步发展,直到20世纪80年代中后期,研究者开始通过基因表达的方式制备重组的生长激素,并逐步地应用于实践中。虽然生长激素能促进动物的生长,但动物产品中激素残留的问题也日益受到关注,所以包括中国在内的世界上大多数国家禁止在动物生产中使用外源性生长激素(Casciano,2000)。因此,探究生长激素安全有效的替代物迫在眉睫。本研究通过改良的两步胶原酶灌流法分离培养大鼠肝脏细胞,并鉴定其生长激素受体活性,以期为基于肝脏细胞模型的科研奠定基础。1材料和方法1.1试验动物1.2胶原酶和pab23-peWME培养基和胎牛血清均购自Gibco公司;地塞米松、牛胰岛素和Ⅳ型胶原酶均购自Sigma公司;Ⅰ型鼠尾胶原购自BD公司;Mab263-PE购自SantaCruz公司。高速冷冻离心机购自Hitach公司;CO2培养箱购自Sanyo公司;倒置相差显微镜购自Olympus公司。1.3g/cm2用0.02mol/L冰醋酸稀释鼠尾胶原至50μg/cm2。按照5μg/cm2包被细胞培养板,室温包被1h,吸出残余液体,用无血清培养基清洗3次,直接使用或4℃保存,于1周内使用。1.4肝脏组织病理学分离SD大鼠肝脏细胞的分离采用在Seglen法的基础上略加改进的两步原位灌流法。SD大鼠试验前12h禁食,4h禁水。腹腔注射戊巴比妥钠(30mg/kg)麻醉SD大鼠,仰卧位固定,腹部皮肤消毒,沿正中线切开腹腔,暴露下腔静脉并注射肝素钠(100~150U/kg)(孙巍等,2009)。分离并结扎门静脉和下腔静脉的远心端和上腔静脉,上腔静脉近心端插管并固定后,剪开下腔静脉近心端,前灌流液为37℃预温的含EDTA及无钙、镁离子的D-Hank’s液,以20~40mL/min的速度灌注5~10min,以去除肝脏内血液及钙离子,肝脏变为黄白色;改以0.05%胶原酶溶液灌流约20min,肝脏被膜下组织呈龟背状裂隙(于聪慧等,2000;Fitzgerald等,2001;陈钟等,2003)。取下肝脏,置于4℃盛有D-Hank’s液的容器中,剪刀划破肝脏包膜,弯钳撕去其表面的包膜,剔除大块纤维结缔组织,将肝脏细胞及肝血窦内皮细胞轻柔分离,收集细胞悬液,用8层纱布过滤后,再用200目的无菌铜网过滤,除去大的细胞团。400r/min离心5min,弃上清,在沉淀中加入WME培养液,制成肝脏细胞悬液。重复离心步骤3次,肝脏细胞密度调整到1×105/mL。台盼蓝染色,在光镜下计算肝脏细胞的产率和活率(Block等,1996)。1.5新生长培养液的制备将细胞用生长培养液(10%胎牛血清+2%双抗+WME基础培养液)制成悬液并进行细胞计数,调整细胞浓度为1×105/mL,以1mL接种于24孔培养板中,在37℃、5%CO2、饱和湿度的条件下培养4h后,更换为新生长培养液(5%胎牛血清+2%双抗+WME基础培养液),以后每24h更换一次新生长培养液(Tateno等,1996;余莹等,2008;蔡大伟等,2009)。1.6肝脏疾病的形态观察每次换液后,在倒置显微镜下观察细胞生长情况及形态变化,拍照并记录。1.8细胞活力检测取新制备并调节细胞浓度为1×105/mL的肝脏细胞悬液2mL,1000r/min离心10min,向该沉淀中加入1mL4%甲醛溶液固定10min,1000r/min离心5min,用PBS(pH7.4)洗涤,重复3次;在-20℃条件下,90%甲醇透化作用20min;1000r/min离心5min,用PBS(pH7.4)洗涤,重复3次;加入2mLPBS重悬细胞,向该悬液中加入0.02mLMab263-PE,充分混匀,37℃培养箱内避光孵育30min;1000r/min离心5min,用PBS(pH7.4)洗涤,重复3次;加入0.02mLHoechst染核液,避光,室温作用10min;用PBS(pH7.4)洗涤,重复3次;加入适量的90%甘油封片,通过奥林巴斯荧光共聚焦显微镜对细胞进行观察和图片信息采集(Casciano,2000;Eleswarapu等,2008)。1.9统计分析软件数据经Excel2003初步处理后,采用SPSS12.0软件进行统计分析。试验各组之间的差异采用单因子方差(One-WayANO-VA)分析,结果用平均值±标准误表示。2结果与分析2.1细胞培养和分离平均每只大鼠可获取2.12×108个肝脏细胞,平均活率达到94.23%。倒置显微镜观察结果显示,新分离的肝脏细胞分散状态良好,呈透亮的圆球形(图1A);24h后绝大多数细胞贴壁、伸展,呈扁平状,体积明显增大(图1B);48h后肝脏细胞贴壁牢固,并开始连接成片,很少有上浮细胞(图1C);培养5d的细胞伸展并贴壁牢固,有少许漂浮死细胞,可通过换液除去(图1D);培养10d的细胞开始出现空泡,细胞质也开始出现颗粒化,细胞核有的已经消失,细胞皱缩间隙变大(图1E);培养15d后细胞脱壁现象严重(图1F),表明细胞渐渐死亡。2.2合成alb及漏出量利用CL-800全自动生化分化仪对1周内培养液中的Alb、LDH和尿素含量进行检测,结果表明,Alb的变化呈先增加后降低的趋势,其中第3天Alb的合成量均显著高于第1、2、4、5、6和7天(P<0.05)。LDH的漏出量在第3和4天最低,其中第3天均显著低于第1、2、5、6和7天(P<0.05)。尿素的合成量呈先增加后降低的趋势,其中峰值出现在第4天,但与其他天数相比均差异不显著(P>0.05)(表1)。2.3抗以肝胰腺组织中大鼠肝脏中的抗感染剂激光共聚焦观察结果表明,Mab263-PE单抗不仅能结合到大鼠肝脏细胞生长激素受体上,且能内化进入细胞质内。Hoechst染核结果表明,肝脏细胞状态良好,分散均匀(图2)。3讨论3.1glen两步胶原酶灌注法肝脏细胞分离与培养是细胞生物学、肝脏细胞移植、病毒性肝炎及生物人工肝脏的重要基础,在体外如何培养获得大量、高纯度、高活力、细胞功能较完整的肝脏细胞,分离技术是至关重要的。最初主要是利用机械法分离肝脏细胞,但该法对细胞损伤严重,很难分离到活性高的肝脏细胞,且数量较少(Yu等,2012)。Seglen两步胶原酶灌注法是目前最常用的肝脏细胞分离方法,该法对细胞膜的损伤小、形态好、分离细胞较彻底且肝脏细胞活性较高,但需特殊的恒流灌注装置、大量的胶原酶,再加上价格较昂贵,限制了其广泛应用(Block等,1996)。如何获得大量高活力的游离肝脏细胞,分离方法及各种Buffer的pH、用量、温度和作用时间是非常重要的。门静脉插管应迅速,灌注及消化时间应充分,肝脏不能有空气栓塞或梗塞,离心速度300r/min即可。胶原酶在体外环境中极易失活,最好现用现配,且最好始终保持在37℃,以提高胶原酶活性。本试验采用0.05%Ⅳ型胶原酶(pH7.4)循环灌流约20min,效果最佳,且节约经费支出。在肝脏细胞培养中培养基的选择很重要,品牌和类型的不同差别很大,对肝脏细胞的培养有显著影响。本试验采用WME培养基,并加入了胰岛素、转铁蛋白和胰高血糖素来改善肝脏细胞的体外培养环境,以保持肝脏细胞的体外增殖能力,延长其存活时间。结果表明,肝脏细胞生长良好,最长可存活15d。3.2ldh的漏出量及胰岛素合成能力试验结果显示,在第3天时,Alb含量较高,表明细胞活力较好,具有一定的增殖能力。LDH是细胞损害最敏感的内酶之一(Kreamer等,1986),本研究结果显示在第3~4天时,上清液中LDH漏出量较少,表明细胞膜受刺激后需3d左右的时间才能修复,随后LDH的漏出量上升可能与肝脏细胞的部分老化、脱落及死亡有关。尿素的合成能力是衡量肝脏细胞功能的重要指标之一,本研究结果发现在第3~4天尿素的含量较高,表明此阶段细胞的氨基酸和蛋白质的合成及代谢功能较强;随后其含量降低,表明细胞逐渐开始凋亡。本研究结果表明分离的肝脏细胞培养第3天时,功能活性处于最佳状态。3.3激素受体的检测Mab263-PE单抗是能与生长激素受体胞外结合蛋白特异性结合的商品化抗体之一,是鉴定生长激素受体的经典抗体。本研究结果表明,通过改良的两步胶原酶灌流法分离的大鼠肝脏细胞状态良好且细胞损伤较小,受体的功能尚未受损。健康SD大鼠,体重100~120g,购自吉林大学动物实验中心。饲喂标准的大鼠饲料,自由饮水,12h昼夜轮回光照,按环境卫生