北京化工大学课件第三章2 高效液相色谱

高效液相色谱HighPerformanceLiquidChromatography(HPLC)12高效液相色谱一概述二液相色谱仪三HPLC检测器四各种色谱方法五HPLC分离利用3一、概述－定义高效液相色谱以液体作为流动相的色谱过程4一、概述－特点高压---150~350x105Pa高速---小于1h高效---3万塔板/米（气相色谱2000塔板/米）高灵敏度---10-9~10-11g5GC与HPLC比较

GCHPLC流动相惰性气体（无亲和性，只起运载作用）气体、沸点较低的化合物不同极性的液体（有一定亲和作用）温度较高一般室温分析对象高沸点、不稳定的天然产物、生物大分子、高分子化合物6

一、概述-分类

(1)分配色谱(2)吸附或液固色谱(3)离子色谱(4)凝胶色谱或尺寸排阻色谱

7二、各种色谱方法（一）分配色谱

（二）吸附色谱（三）离子交换色谱法

（四）排阻色谱法8（一）分配色谱分配色谱液液分配色谱(LLPC)键合固定相分配色谱(LSPC)

(PartitionChromatography)液体固定相通过物理吸附固定于载体表面有机分子通过化学反应键合到载体表面9（一）分配色谱–分离原理分离原理不同组分在两相间分配系数不同10（一）分配色谱-固定相固定相---物理吸附（担体+固定液）全多孔型担体薄壳型微珠担体11R---极性基团疏水基团固定相---化学键合（一）分配色谱-

固定相12HPLC的固定相的化学构造非键合相表面键合相表面ODCC18C8C1Phenyl-NH2-CN13正相分配色谱反相分配色谱固定相性质极性非极性键合基团

极性基团疏水基团流动相性质非极性极性出峰顺序极性小先出极性大先出14（二）吸附色谱–分离原理分离原理溶质与流动相分子在吸附剂表面上的吸附竞争15（二）、吸附色谱-固定相

以固体吸附剂为固定相，如硅胶、氧化铝等，较常使用的是5～10μm的硅胶吸附剂。流动相可以是各种不同极性的一元或多元溶剂。固定相16（三）、离子交换色谱固定相为离子交换树脂，流动相为无机酸或无机碱的水溶液。各种离子根据它们与树脂上的交换基团的交换能力的不同而得到分离。分离原理固定相17分离对象离子或可离解的化合物（三）、离子交换色谱（无机离子、氨基酸、蛋白质等）18（四）排阻色谱法

分离原理根据样品分子尺寸大小分离

大分子不能进入多孔中，不被保留，随Vm流出中分子部分进入多孔中，一般保留小分子完全进入多孔中，长时间保留。191.软凝胶：铰链葡萄糖的多孔聚合物，聚丙烯酰胺凝胶。（凝胶过滤色谱）2.半硬凝胶：聚苯乙烯珠（凝胶渗透色谱）高硬凝胶和玻璃：多孔玻璃或多孔硅球，经化学键合处理，不随压力及溶剂改变尺寸，（高效排阻色谱）

固定相20高分子化合物分子量及分子量分布DNA碎片不同碱基支链分离。应用（四）排阻色谱法

21极性水不溶性水溶性非极性物质离子极性非离子型排阻凝胶渗透凝胶过滤吸附反相分配色谱正相分配色谱分配离子交换HPLC应用概图

22流动液贮存提供脱气输液泵进样系统分离系统检测系统控制与记录系统

三、液相色谱仪

23LC系统24251.流动相贮存与脱气

（1）真空泵抽滤系统（2）低溶性惰性气体导入替换（3）超声脱气脱气方法262.

输液系统

活塞泵注射泵气动泵27活塞泵工作原理28注射泵

293.进样系统不使整个压力变化的情况下将样品注入色谱柱，通常使用所谓六通阀样品环样品先用0.4微米的滤膜过滤30样品环314、色谱柱柱长：5cm–25cm内径：3-5mm粒径：3-5μ

m柱管：不锈钢32常用的柱子柱长：15cm或25cm内径：4.6mm粒径：5μ

m塔板数：40000-70000plates/meter10000plates/column33微柱柱长：3cm-7.5cm内径：4.6mm粒径：3-5μ

m塔板数：100000plates/meter34保护柱（guardcolumn)置于分析柱前的短柱，填料与分析柱基本相同，但粒径略大，避免增大柱压。用于除去污染物355.HPLC检测器

溶液：折光，介电常数，密度溶质：吸光光度，荧光光度，扩散电流等（1）.

吸光检测器（2）.

红外检测器（3）.

荧光检测器（4）.

折光检测器（5）.

电化学检测器（6）.

质谱检测器36常用LC检测器

名称使用量商品化灵敏度价格吸光度71%Yes100pg-1ng1荧光13%Yes1-10pg2-20电化学4.3%Yes10pg-1ng1-2折光5.4%Yes100ng-1µg1-电导

Yes500pg-1µg1-质谱

No

1000FTIR

Yes1µg10005光散射

Yes981ng

光离子化

No1pg-1ng

元素选择

No10ng

37（1）吸光检测器单波长UV检测器，光源用Hg灯