现代仪器分析HPLC课件

本章内容介绍第一节概述第二节高效液相色谱仪第三节高效液色谱法的基本理论第四节各类高效液色谱法第五节固定相第六节流动相第七节HPLC分析条件的选择第八节定性与定量分析第九节LC-MS联用技术简介第十节超临界流体色谱法简介本章内容介绍第一节概述第一节概述

HPLC是在经典液相色谱基础上引入GC的理论和技术,采用：高速——高压泵高效——固定相；高灵敏度——检测器第一节概述

HPLC是在经典液相色谱基础上引入GCHPLC与经典液相色谱的比较

高速：HPLC采用高压输液设备，流速大增加，分析速度极快，只需数分钟；而经典方法靠重力加料，完成一次分析需时数小时。高效：填充物颗粒极细且规则，固定相涂渍均匀、传质阻力小，因而柱效很高。可以在数分钟内完成数百种物质的分离。高灵敏度：检测器灵敏度极高：UV——10-9g,荧光检测器——10-11g。HPLC与经典液相色谱的比较

高速：HPLC和GC的比较流动相：

HPLC液体种类多，可选范围多GC气体，种类少，改变载气影响柱效和分离少固定相：

HPLC新型吸附剂，化学键合相，粒度小GC吸附剂，担体+吸附剂，粒度大应用范围：

HPLC高沸点，难挥发，对热不稳定物质GC低沸点，易挥发，对热稳定物质此外，HPLC流出组分可以收集，检测器灵敏度高。HPLC和GC的比较流动相：高效液相色谱仪高效液相色谱仪第二节高效液相色谱仪HPLC仪组成：输液系统;进样系统;分离系统;检测系统;数据处理系统。第二节高效液相色谱仪HPLC仪组成：输液系统;进样系统流程及主要部件

processandmainassemblyofHPLC1.流程流程及主要部件

processandmainasse主要部件输液系统（一）流动相贮器耐酸碱的瓶子（棕色或无色），高于泵体，保持输液静压差。主要部件输液系统（二）脱气装置液体流动相使用前要脱气，除去其溶解的气体。（基线噪音，氧化组分！！）方法：（1）超声波振动脱气（2）抽真空脱气（3）加热回流脱气（4）吹氦脱气（5）真空在线脱气（二）脱气装置(三)高压输液泵要求：流量准确可调，耐高压（30MPa），液流稳定，泵的死体积小。为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（<10μm），液体的流动相高速通过时，将产生很高的压力。应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性(三)高压输液泵双泵串联补偿法将两个柱塞杆往复泵串联,泵1比泵2体积大一倍,柱塞杆运动方向相反。（目的是：减少输液脉冲）泵1泵2色谱柱吸（排）排（吸）双泵串联补偿法泵1泵2色谱柱吸（排）排（吸）(四)梯度淋洗装置梯度洗脱：分离过程中，随时间函数程序地改变流动相的组成（极性，PH或离子强度）。类型：高压梯度低压梯度(四)梯度淋洗装置梯度洗脱：分离过程中，随时间函数程序地改变外梯度（二元高压梯度）:

利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。内梯度（四元低压梯度）

:一台高压泵,通过比例调节阀,将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。外梯度（二元高压梯度）:内梯度（四元低压梯度）二.进样系统

（一）六通进样阀

流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压的六通阀进样装置，其结构如图所示：优点：进样精确，重现性好。二.进样系统（一）六通进样阀优点：三.色谱分离系统（一）保护柱

位置：接在色谱柱之前，保护色谱柱。柱体为直型不锈钢管，内径1～6mm，柱长5cm。填料跟分析柱一样，粒径大。三.色谱分离系统（一）保护柱（二）色谱柱柱体为直型不锈钢管，内径1～6mm，柱长5～40cm。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。常用的分析柱是内径2～4.6mm，柱长10～25cm（二）色谱柱柱体为直型不锈钢管，内径1～6mm，柱长5～4（三）柱恒温箱精确控制柱温可以提高保留时间的重现性。柱温升高，保留时间减少。常用温度：室温-65度（三）柱恒温箱精确控制柱温可以提高保留时间的重现性。（四）色谱柱柱效的评价《中国药典》05版规定：建立HPLC法时，需要进行“色谱条件与系统适应性”实验。最佳分离状态下色谱柱应达到的：n理论？分离度R？拖尾因子T？（四）色谱柱柱效的评价《中国药典》05版规定：建立HPLC法四.检测系统检测器：检测器分为溶质性检测器（只对流动相中的被分离分析组分的物理或物理化学性质有响应）和总体型检测器（对流动相的总的物理或物理化学性质有响应）。（1）溶质性检测器：紫外（UVD）、荧光（FLD）、电化学（ECD）检测器等。四.检测系统检测器：检测器分为溶质性检测器（只对流动相中的紫外检测器—基于被测组分对特定波长的紫外光的选择性吸收，且吸收符合光吸收定律。因此可以进行定性定量分析。a．固定波长型检测器—是一种光源波长固定的紫外光度计，一般由低压汞灯作光源，发射波长为254nm波长的光。对在254nm波长附近有吸收的物质有响应。b．可变波长型检测器—是一台紫外可见分光光度计，波长任意可调。紫外检测器—基于被测组分对特定波长的紫外光的选择性吸收，且吸

a.b.紫外检测器应用最广，对大部分有机化合物有响应。特点：

灵敏度高；线形范围高；流通池可做的很小（1mm×10mm，容积8μL）；对流动相的流速和温度变化不敏感；波长可选，易于操作；可用于梯度洗脱。

a.b.紫外检测器c.光电二极管阵列检测器（PDAD）一种新型记录方式的紫外检测器，紫外检测器的重要进展；光电二极管阵列检测器组成：它由光源、光栅、1024个二极管阵列（各检测特定波长），计算机。光源发射的光被组分选择性吸收，经光栅分光后照射到二极管阵列上，使每纳米光波的光强变成相应的电信号，经累积和计算机处理后得到试样或每个组分的吸收光谱。可以获得t、A、λ的三维图－光谱和色谱图的加合图。c.光电二极管阵列检测器（PDAD）一种新型记录方式的紫外现代仪器分析HPLC课件光电二极管阵列检测器光电二极管阵列检测器光电二极管阵列检测器应用三维时间-色谱-光谱图除了定量外，可以综合定性分析:(1)色谱峰的纯度检查(2)色谱峰的分离状况光电二极管阵列检测器应用三维时间-色谱-光谱图（二）蒸发光散射检测器（evaporativelight-scatteringdetector,ELSD

ELSD是基于溶质的光散射性质的检测器。ELSD属通用型和质量型检测器由雾化器、加热漂移管（溶剂蒸发室）、激光光源和光电转换器等部件构成。（二）蒸发光散射检测器（evaporativelight-检测过程：

流出液雾化成微细液滴通过加热漂移管时溶剂被蒸发掉，留下溶质激光束照在溶质颗粒上产生光散射，光收集器收集散射光并通过光电倍增管转变成电信号。散射光强度正比组分的量检测过程：流出液雾化成微细液滴通蒸发光散射检测器ELSD应用散射光强只与溶质颗粒大小和数量有关，而与溶质本身的物理和化学性质无关，ELSD属通用型和质量型检测器。适合于无紫外吸收、无电活性和不发荧光的样品的检测。（糖类，甾体皂甙，脂肪酸等）其灵敏度与载气流速、汽化室温度和激光光源强度等参数有关。它的基线漂移不受温度影响，信噪比高，也可用于梯度洗脱。蒸发光散射检测器ELSD应用散射光强只与溶质（三）荧光检测器

（fluorescencedetector）高灵敏度、高选择性；能在紫外光激发下能产生荧光的物质。多环芳烃，维生素B、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有响应；（三）荧光检测器

（fluorescencedetec（四）示差折光检测器

（differentialrefractiveindexdetector）除紫外检测器之外应用最多的检测器；可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数差值。差值与浓度呈正比通用型检测器（每种物质具有不同的折光指数）；灵敏度低、对温度敏感、不能用于梯度洗脱；

（四）示差折光检测器

（differentialref五数据处理系统记录仪+工作站六仪器性能指标

分离性能：流量精度，噪声，漂移，线性检测性能：比如UV有波长的准确度五数据处理系统记录仪+工作站现代仪器分析HPLC课件第三节高效液色谱法的基本理论

基本理论及色谱流程与气相色谱法相似；如塔板理论、速率理论、保留值、分离度等都可用于高效液相色谱法。两者不同的是流动相，因而在基本理论方面需要考虑这些特点。其影响最大的是速率理论。描述其板高与影响因素关系的范氏方程如下：

涡流纵向传质阻力

H＝A＋B/u＋Cu第三节高效液色谱法的基本理论

基本理论及色谱流程与气相色但在液相色谱中流动相是液体，黏度大，柱温低，扩散系数小，所以B/u很小可以忽略，则：

H＝A＋Cu因此：（1）从A项考虑：A=2λdp

①减小dp，小粒固定相，可以提高柱效；②降低λ采用球形，颗粒均匀分布的固定相，有利于提高柱效；但在液相色谱中流动相是液体，黏度大，柱温低，扩散系数小，所以（2）从C项考虑：在HPLC中：C=Cm+Csm+Cs通常采用化学键合相，固定液被键合到载体的表面。所以

C=Cm+CsmH＝A+Cm+Csm范式方程提高柱效的方法：（1）减小dp，采用球形小粒固定相，化学键合相（2）低黏度流动相，低流量（1ml/Min）（3）柱温25-30（2）从C项考虑：第四节各类高效液色谱法一、液-液分配色谱法二、液-固吸附色谱法三、离子交换色谱法四、离子色谱五、离子对色谱六、排阻色谱色谱第四节各类高效液色谱法一、液-液分配色谱法一、液-液分配色谱

固定相与流动相均为液体（互不相溶）；基本原理：组分在固定相和流动相上的分配；固定相：早期涂渍固定液，固定液流失，采用化学键合固定相（一）正相分配色谱亲水性固定液+疏水性流动相，即流动相的极性小于固定液的极性；分离物质：强极性化合物（糖类和多肽类）；极性大的后出峰；氰基化学键合相：诱导力，分离可极化的物质

氨基化学键合相：诱导力+氢键作用力一、液-液分配色谱

固定相与流动相均为液（二）反相分配色谱疏水性固定液+亲水性流动相，流动相的极性大于固定液的极性。分离物质：非极性化合物（广泛）；极性小的后出峰；十八烷基键合相：（将各种不同基团通过化学反应键合到硅胶（担体）表面的游离羟基上。C-18柱（ODS反相柱）。疏溶剂理论：

烃基键合相，强疏水性，组分中非极性部分与烃基键合相结合。亲水性流动相使组分分离。（二）反相分配色谱疏水性固定液+亲水性流动相，流动二、液-固吸附色谱

liquid-solidadsorptionchromatography固定相：固体吸附剂为，如硅胶、氧化铝等，较常使用的是5～10μm的硅胶吸附剂；流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂。基本原理：组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸；适用：分离相对分子质量中等的脂溶性试样，对具有官能团的化合物和异构体有较高选择性；缺点：非线形等温吸附常引起峰的拖尾；二、液-固吸附色谱

liquid-soli三、离子交换色谱

ion-exchangechromatography

固定相：阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂；早期采用的离子交换树脂被离子键合相代替。

流动相：阳离子离子交换色谱，采用碱性水溶液；阴离子离子交换色谱，采用酸性水溶液；

三、离子交换色谱

ion-exchang基本原理：组分在固定相上发生的反复离子交换反应；组分与离子交换剂之间亲和力的大小与离子半径、电荷、存在形式等有关。亲和力大，保留时间长；阳离子交换：R—SO3H+M+=R—SO3M+H+

阴离子交换：R—NR4OH+X-=R—NR4X+OH-应用：离子及可离解的化合物，有机和无机分离，氨基酸、核酸等。基本原理：组分在固定相上发生的反复离子交换反应；组分与离子交四、离子色谱

ionchromatography（IC）

离子色谱是与离子交换色谱的区别：采用了特制的、具有极低交换容量的离子交换树脂作为柱填料，并采用淋洗液抑制技术和电导检测器，是测定混合阴离子的有效方法。

四、离子色谱

ionchromatography（I一、离子色谱法原理

以无机、特别是无机阴离子混合物为主要分析对象,在七十年代出现、八十年代迅速发展。传统离子交换色谱存在着两个难于解决的问题：(1)需要高浓度淋洗液洗脱且洗脱时间很长；(2)洗脱后的组分缺乏灵敏、快速的在线检测方法。一、离子色谱法原理

以无机、特别是无机阴离子混合物为主离子交换原理，与传统离子交换的不同点：采用交换容量非常低的特制离子交换树脂为固定相；细颗粒柱填料，高柱效；采用高压输液泵；低浓度淋洗液或本底电导抑制（在分离柱后，采用抑制柱来消除淋洗液的高本底电导）；可采用电导检测器，快速分离分析微量无机离子混合物；各种抑制装置及无抑制方法的出现，发展迅速。离子交换原理，与传统离子交换的不同点：2.离子色谱具有以下优点（1）分析速度快

可在数分钟内完成一个试样的分析；（2）分离能力高

在适宜的条件下，可使常见的各种阴离子混合物分离；例：使用双柱法，在十几分钟内，可使七种阴离子完全分离。（3）分离混合阴离子的最有效方法（4）耐腐蚀，仪器流路采用全塑件，玻璃柱2.离子色谱具有以下优点（1）分析速度快（2）分离能力高

离子色谱装置类型

抑制型：抑制柱型、连续抑制型

非抑制型:当进一步降低分离柱中树脂的交换容量，使用低浓度、低电离度的有机弱酸及弱酸盐作淋洗液，如苯甲酸、苯甲酸盐等。检测器可直接与分离柱相连，不需抑制柱。离子色谱装置类型

抑制型：抑制柱型、连续抑制型非抑制型:离子色谱抑制装置图阴离子交换：R—NR4OH+X-=R—NR4X+OH-离子色谱抑制装置图阴离子交换：离子色谱连续抑制原理图离子色谱连续抑制原理图离子色谱的应用

阴离子分析:

双柱；薄壳型阴离子交换树脂分离柱(3×250mm),流动相：0.003mol·L-1NaHCO3/0.0024mol·L-1Na2CO3，流量138mL/hr。七种阴离子在20分钟内基本上得到完全分离，各组分含量在3～50ppm。离子色谱的应用

阴离子分析:五、离子对色谱

ionpairchromatography原理：将一种与溶质离子电荷相反的离子（对离子或反离子）加到流动相中使其与溶质离子结合形成疏水性离子对化合物，使其能够在两相之间进行分配，从而控制被分离组分的保留值的色谱法。（LLC法基础上演变来的！）

A++B-=(A+

B-

)org离子对的体积较大，又无净电荷，所以有显著的疏水性；离子有亲水性，离子对有疏水性（亲油性）；故可将萃取原理用来讨论离子对色谱的分离问题。五、离子对色谱

i选择合适的反离子和浓度，就能有效地将被分离组分萃取进有机相。正相离子对色谱：如以水作为固定相，有机溶剂为流动相，离子对容易流出色谱柱；反离子对色谱：反之，则离子对被保留。常用离子对试剂：阴离子分离：常采用烷基胺类，如氢氧化四丁基铵或氢氧化十六烷基三甲胺作为对离子；阳离子分离：常采用烷基磺酸类，如己烷磺酸钠作为对离子；选择合适的反离子和浓度，就能有效地将被分离组分萃取进有机相。六、排阻色谱色谱

size-exclusionchromatography

固定相：凝胶(具有一定大小孔隙分布)；

原理：按分子大小分离。小分子可以扩散到凝胶空隙，由其中通过，出峰最慢；中等分子只能通过部分凝胶空隙，中速通过；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶剂分子小，故在最后出峰。

VR＝V0+KVi

流动相：四氢呋喃、二甲基甲酰胺等）。应用：可对相对分子质量在100-105范围内的化合物按质量分离六、排阻色谱色谱

size-exclusionchro七、胶束色谱（MC）流动相：胶束水溶液，多了一个胶束相，所以有三个界面，三个分配系数，有比较好的选择性。

七、胶束色谱（MC）流动相：胶束水溶液，现代仪器分析HPLC课件HPLC固定相：硅胶，化学键合相，，凝胶，离子交换剂一.硅胶吸附色谱常用，应用广（极性至弱极性物质）。类型：表面多孔硅胶，无定形全多孔，球形全多孔，堆积硅珠第五节固定相表面多孔型型球形全多孔型表面多孔HPLC固定相：硅胶，化学键合相，，凝胶，离子交换剂第五节二．化学键合相

以硅胶为载体，经化学反映后，将固定液的官能团键合在载体的表面上。化学键合相优点：（1）减少固定液的流失，增加色谱柱的使用寿命；（2）化学稳定，PH2-8溶液（3）传质快，柱效高，载样量大封尾：化学反应将载体表面硅醇基出去。二．化学键合相现代仪器分析HPLC课件键合类型：①硅氧碳型（Si-O-C）键合相－醇与硅羟基进行酯化反应得到；易发生水解，目前少用。②硅氧硅碳型（Si-O-Si-C）键合相－硅羟基与有机氯硅烷或烷氧基硅烷反应得到，稳定多用：键合类型：②硅氧硅碳型（Si-O-Si-C）键合相－硅羟基键合类型有：（一）非极性键合相疏水基团－不同链长的烷基，甲基和苯基等；最广：十八烷基键合相（C-18柱或ODS柱）

：将十八烷基通过化学反应键合到硅胶（担体）表面上。。影响因素：1.载体性质：比表面大，键合基团多，k大，t长YWG-C18，YQG-C182.表面覆盖度：表面覆盖度大，残留硅醇基少，则分配占主导地位。3.键合基团的链长：链长增加，极性低，k大载体官能团键合类型有：（一）非极性键合相载体官能团（二）中等极性键合相醚基键合相（ROR），如：YWG-ROR（三）极性键合相分析糖类极性基团－氨基、氰基、醚基和醇基等；

（1）氰基化学键合相：中强极性YWG-CN（2）氨基化学键合相：强极性YWG-NH2三.凝胶（一）半硬质凝胶：苯乙烯和二乙烯苯交联，压缩性，易装柱（二）硬质凝胶：多孔硅胶等无机材料，易碎，柱效低（三）主要性能参数：分子量排斥极限，平均孔径原则：全渗透点的分子量<样品分子量<分子量排斥极限（二）中等极性键合相四.离子交换剂离子键合相－阴离子交换基团胺基、季铵基、阳离子交换基团磺酸基。以含有离子交换基团（磺基、氨基、羧基等）的键合相为固定相。例如:YWG-SO3H,YWG-R3NClZipax-SCX(薄壳型阳离子键合相)四.离子交换剂一.HPLC对流动相的要求：不与固定相发生不可逆化学变化；溶解样品；与检测器相配；粘度小，有利于获得高柱效；廉价、毒性小、易于纯化等。选择原则：“相似相溶”。试样极性、固定相极性及流动相极性之间的配合与经典色谱法相似。第六节流动相一.HPLC对流动相的要求：第六节流动相二.常用流动相溶剂的性质（一）沸点（b.p）：低沸点（二）黏度：黏度太大，C项大，柱效低（三）互溶性：好（四）极性：用罗氏常数描述。调节极性可以使样品组分的k在合适范围。极性参数P:Pab’=φaPa’+φbPb’极性参数与k关系:k2/k1=10(P1’-P2’)/2(正相色谱)k1/k2=10(P1’-P2’)/2(反相色谱)二.常用流动相溶剂的性质三.溶剂的选择性与分类四.不同色谱选不同流动相(一)吸附色谱用流动相通过实验选择。(二)分配色谱用流动相:指导原则1<k<10正相:最常用的流动相：饱和烷烃，如已烷，庚烷反相:最常用的流动相：水、甲醇、乙腈、四氢呋喃、异丙醇等。水－甲醇体系：大约50％水的时候粘度最大水－乙腈体系：35％水的时候粘度最大。三.溶剂的选择性与分类(三)离子交换色谱用流动相缓冲溶液，可以解离离子。(四)尺寸排阻色谱用流动相不需要改变流动相组成来改变分离，只要流动相能溶解样品，黏度低就可以。(三)离子交换色谱用流动相第七节HPLC分析条件的选择一.分离条件的选择(一)分离方法的选择第七节HPLC分析条件的选择一.分离条件的选择考虑分离方法的选择，主要考虑以下三个方面：（1）相对分子量分子量小于200的一般选用气相法；200~2000的选用液－液、液－固、或离子交换色谱法；大于2000的可用排斥色谱法。（2）溶解度水溶性样品最好用离子交换或液－液分配色谱法；微溶于水的，但在酸、或碱存在下能很好离解的，可用离子交换色谱法；油溶性、或相对极性较弱的混合物，可用液－固色谱法。（3）化学结构离子型、或易离子化、或易形成离子对的化合物宜用离子色谱法；异构体的分离，宜用液－固色谱法；同系物的分离，宜用液－液分配色谱法；高分子化合物宜用排阻色谱法。考虑分离方法的选择，主要考虑以下三个方面：(二)梯度洗脱分离指导原则是组分:1<k<10等度洗脱（流动相比例不变）:样品组