《现代分子生物学》第九讲 分子

第九讲分子生物学研究方法

（三）RNA研究技术

（四）蛋白质研究技术2011.10.12

《现代分子生物学》

ModernMolecularBiology本章主要内容：1、分子生物学常用试剂；2、SNP理论及应用；3、RNA研究技术及应用；4、蛋白质分离与纯化。核酸分子杂交及检测

（续）

5、原位杂交

用标记的已知核酸序列为探针，使其与细胞组织或切片中核酸进行杂交检测的方法称为原位杂交。原位杂交的类型：DNA-DNA、DNA-RNA、RNA-RNA杂交。

原位杂交的原理6、整体原位杂交

最初用于研究Drosophila胚胎，接着Xenopus胚胎（Hemmati-Brivanlouetal.1990;FrankandHarland1991)等模式生物。研究动物胚胎发育过程中基因的时空表达及其基因功能的重要手段之一。优点：有利于研究基因表达和胚胎器官或组织形成之间的关系；更直观的了解基因何时、何处在胚胎中表达。整体原位杂交：又叫做全胚胎原位杂交（wholemountinsituhybridization，WISH）是广泛用于胚胎发育调控基因表达研究的一种技术。近年来该技术发展较快，不仅可以检测到较弱的杂交信号，而且可以多色杂交，检测多个基因的表达情况。全胚胎原位杂交的基本原理是用各种标记物标记与体内特定mRNA互补的RNA分子（反义RNA），以它们作为探针与动物的整体胚胎进行原位杂交，然后用相应的抗体来检测特异探针的分布情况。原位杂交的应用：染色体分析显微、亚显微水平的基因表达定位Fig.β-microseminoproteinmRNAinthegastricmucosa.M-cellpartofthemucosaisintenselystained.Fig.RBPexpressioninproliferativezonesoftheE13.5mouseforebrain病原的检测Fig.InsituhybridizationofHIV-1RNAinoralmucosabiopsiesfromananti-HIV-1positiveMagnification400.转基因的检测FigThemousetransgenecontainedabetageoreportergeneasindicatedbyX-galstainingofaday12.5transgenicembryo(right),expressionismainlyconfined,asexpected,tothefetalliver.Thecontrolembryo(left)showsnostaining.Expressionofcrescent,frzb-1,sfrp-2andsizzledinXenopusembryosbywhole-mountinsituhybridization.DynamicexpressionofcrescentduringearlyXenopusdevelopment.Overexpressionofcrescent,butnotoffrzb-1,resultsincyclopia.

Whole-mountinSituHybridization三、SNP的理论与应用单核苷酸多态性（SingleNucleotidePolymorphisms，SNPs）是指基因组DNA序列中由于单个核苷酸（A，G，C，T）插入、缺失、转换和颠换等而引起的多态性。SNP在基因组中分布相当广泛，近来的研究表明在人类基因组中每300碱基对就出现一次。大量的SNP位点，使人们有机会发现与各种疾病，包括肿瘤相关的基因组突变；从实验操作来看，通过SNP发现疾病相关基因突变要比通过家系来得容易；有些SNP并不直接导致疾病基因的表达，但由于它与某些疾病基因相邻，而成为重要的标记。SNP在基础研究中也发挥了巨大的作用，近年来对Y染色体SNP的分析，使得在人类进化、人类种群的演化和迁徙领域取得了一系列重要成果。

SNP与疾病

1996年，Lander报道了用单核苷酸多态性标记（singlenucleotidpolymorphismSNP）制备第三代遗传连锁图的遗传标记。

一种是同义SNP(synonymous,SNP),即SNP所致的编码序列的改变并不影响其所翻译的蛋白质的氨基酸序列；另一种是非同义SNP(non-synonymousc,SNP),指碱基序列的改变可使以其为蓝本翻译的蛋白质序列发生改变，从而影响了蛋白质的功能。这种改变常是导致生物性状改变的直接原因。SNP中约有一半为非同义SNP。SNP分类:人类基因单体型图的绘制;绘制人类基因单体型图，描述人类常见的遗传多态性模式和染色体上具有成组紧密关联SNPs的区域。

SNP与疾病易感基因的相关分析;遗传标记的频率在患者中明显超过非患者时，就表明该标记基因可能与这种疾病相关。指导用药与药物设计;通过研究SNPs与个体对药物敏感或耐受的相关性研究，可能阐明遗传因素对药效的影响，对患者施行个性化用药。SNP应用Majorchangesinproteinstructurecanresultfromsubtlevariationinthegeneticsequenceencodingit.Thesechangescancompletelyblockthefunctionoftheproteininvivoandcanalsoaffectthedevelopmentofhigh-throughputassaysforscreeningtherapeuticcompounds.四、基因芯片技术基因芯片（DNAchip），又称DNA微阵列（DNAmicroarray）技术是能同时监测大量靶基因表达的实验手段，从而迅速准确地在基因组水平上阐述不同生物组织或细胞中各种转录本的变化规律。DNA芯片，又称基因芯片(Genechip)，是指将许多特定的寡核苷酸片段或基因片段作为探针，有规律地排列固定于支持物上，样品DNA/RNA通过PCR扩增、体外转录等技术掺入标记分子，然后按碱基配对原理进行杂交，再通过检测系统等对芯片的杂交信号进行量化，得出所要的信息。特点－－微量化、大规模、并行化、高度自动化地处理感兴趣的生物样品，精细地研究组织细胞基因表达情况，了解各种状态下分子结构变异和分子病理过程，并为寻找合适的医药或疫苗。基因芯片DNA芯片实验流程1.芯片设计2.待测样品制备3.杂交反应4.结果探测5.数据处理基因芯片技术包含280个棉花cDNA的简易芯片

大规模基因芯片基因芯片的应用芯片技术中杂交测序技术；定量监测大量基因表达水平；基因多态位点及基因突变的检测；基因芯片用于药物领域；DNAchip在临床上的应用前景1.疾病诊断;2.药物筛选;3.指导用药及治疗方案;实验设计腺瘤或腺癌患者正常组织切片腺瘤或腺癌组织切片正常组织肿瘤组织疾病发展过程

正常结肠腺瘤

结肠腺癌表达谱比较正常22腺瘤4腺癌18RNA分析技术RNAmRNAncRNANon-codingRNA.TranscribedRNAwithastructural,functionalorcatalyticrolerRNARibosomalRNAParticipateinproteinsynthesistRNATransferRNAInterfacebetweenmRNA&aminoacidssnRNASmallnuclearRNAIncl.RNAthatformpartofthespliceosomesnoRNASmallnucleolarRNAFoundinnucleolus,involvedinmodificationofrRNAmiRNAMicroRNASmallRNAinvolvedregulationofexpressionOtherIncludinglargeRNAwithrolesinchromotinstructureandimprintingsiRNASmallinterferingRNAActivemoleculesinRNAinterferencestRNASmalltemporalRNA.RNAwitharoleindevelopmentaltimingRNA分析技术的目的：RNA表达的数量、时间、空间定位及功能分析

一个典型的哺乳动物细胞中含有约10-5μgRNA，其中80-85%是核糖体RNA，剩余的15%-20%中大部分由不同的低相对分子质量的RNA组成（如转运RNA和小核RNA）。因为核糖残基在2’和3’位带有羟基，所以RNA比DNA的化学性质更活跃，易于被污染的RNA酶—具有水解核糖残基和磷酸间二酯键能力的酶切割。一、RNA基本操作技术常用的RNA分析方法：（1）PCR:

RT-PCR（ReverseTranscriptionPCR,Real-timeRT-PCR（2）原位杂交（Insituhybridization）（3）NorthernBlot

（4）RNAinterferenceRT-PCR原理：提取组织细胞总RNA，以其中的mRNA为模板，采用olig-dT或随机引物，在逆转录酶的作用下反转录成cDNA。再以cDNA作为模板，通过特异性引物，PCR扩增目的基因。应用：分析基因的转录产物；获取目的基因；合成cDNA探针；构建RNA高效转录系统。RealtimeRT-PCR基线：baseline,是背景曲线的一段，范围从反应开始不久荧光值开始变得稳定，直到所有反应管的荧光都将要，但是还未，超出背景。）.Threshold:荧光（Rn）超过本底——达到可检测水平时的临界数值。.Ct:thresholdcycle，临界循环数，threshold横线与扩增曲线相交，所得交点所对应的循环数。RealtimeRT-PCR的应用1、基因表达分析研究;2、基因分型及突变检测;3、病源微生物及转基因食品的检测;杂合体个体的DNA扩增产物则可同时与Tet和Flr标记的探针结合同型突变型个体的扩增DNA只与Tet或Flr标记的探针结合NorthernBlot原理：RNA经过变性琼脂糖凝胶电泳分离后，转移到硝酸纤维膜或尼龙膜上，经过杂交，分析mRNA的大小及含量。应用：半定量分析mRNA的含量；确定mRNA分子的大小。方法：提取组织细胞总RNA→RNA定量→变性胶电泳→转膜→干膜→预杂交→杂交→洗膜→压片→洗片→图像分析。变性胶的制备：琼脂糖0.2g，加入DEPC水12.4ml，加热熔化，稍冷后加入5×甲醛凝胶电泳缓冲液4.0ml、37%甲醛3.6ml，混匀、制胶。待胶凝固后，置1×甲醛凝胶电泳缓冲液中预电泳5分钟。注意事项：（1）RNA的完整性;（2）转膜完全;（3）探针标记的效率、变性;（4）防同位素污染;（5）压片曝光时间。1、RNA的分离与纯化：控制RNA酶的活性：1、控制污染：（1）专用的RNA操作室、专用器械;（2）操作时戴手套;（3）实验用器皿、吸头、离心管应为新的;（4）所配制的水溶液，尽可能用DEPC（焦碳酸二乙酯）处理。2、已污染RNA酶的器具的处理（1）在180℃的高温下干烤6小时或更长时间;（2）氯仿冲洗;（3）双氧水（3%）浸泡;（4）0.1%DEPC水浸泡。在所有RNA实验中,最关键的因素是分离得到全长的RNA，实验失败的主要原因是RNA酶的污染。3、常用的RNA酶抑制剂：（1）焦碳酸二乙酯（DEPC）：一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂，通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应从而抑制酶的活性。（2）异硫氰酸胍：最有效的RNA酶抑制剂。在裂解组织细胞的同时，也使RNA酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中分离出来，又对RNA酶有强烈的变性作用。（3）氧钒糖核苷复合物：由氧化钒离子和核苷形成的复合物，与RNA酶结合后几乎能完全抑制RNA酶的活性。（4）RNA酶的蛋白抑制剂（RNasin）：从人胎盘中分离出来，可以和多种RNA酶结合，使其失活。（5）其它：SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定的抑制作用。4、RNA的提取：常用的RNA提取方法：

异硫氰酸胍法、盐酸胍法、RNAzol(Trizol)法。RNAzol法的特点：方便、快速、得率高。但所用试剂价格贵，仅适用于小量提取。Trizol法提取组织中总RNA1、取新鲜组织约50-100mg，加入1mlTrizol，室温充分匀浆，静置5分钟。2、加入0.2ml氯仿，振荡15秒，静置2分钟。3、4℃，12000g×15分钟，取上清。4、加入0.5ml异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10分钟。5、4℃，12000g×10分钟，弃上清。6、加入1ml75%乙醇，轻轻洗涤沉淀。4℃，7500g×5分钟，弃上清。7、晾干，加入适量的DEPC水溶解（65℃促溶15分钟）。8、定量：在紫外分光光度计上测定OD260和OD280。RNA样品的浓度测定：

RNA(mg/ml)=40×OD260×稀释倍数/1000

RNA纯度分析：

RNA纯品的OD260/OD280为1.8-2.0，可根椐OD260/OD280值估计RNA的纯度。比值低，提示有蛋白质污染；比值过高，提示RNA可能降解。5、RNA的纯化：

采用OligodT-纤维素，从总RNA中分离出mRNA。该法利用mRNA3’末端有Poly（A）的特点，在总RNA流经寡聚（dT）-纤维素柱时，在高盐缓冲液的作用下，mRNA被特异地结合在柱上，当逐渐降低盐的浓度洗脱时，mRNA被洗脱下来。一般而言，经过二次OligodT柱后，可得到较高纯度的mRNA。蛋白质研究技术1、蛋白质研究基本操作蛋白质分离

(ProteinseparationbyPAGEgelelectrophoresis);WesternBlot分析;蛋白质纯化

(Proteinpurification);层析法纯化

(Affinitychromatography;canfacilitatemorerapidproteinpurification);蛋白质测序

(Proteinsequencing);蛋白质组学

(Proteomics)。蛋白质分离与纯化;

(Proteinseparationandpurification);蛋白质的盐析;

等电点沉淀法;

凝胶电泳;

透析和超过滤;

密度梯度离心;离子交换层析法;

亲和层析法;

ProteinseparationbyPAGEgelelectrophoresis蛋白质分离PAGE电泳分离蛋白Thenativeproteinshaveneitherauniformchargenorauniformsecondarystructure.IfwetreattheproteinwithastrongdetergentSDS,thehigherstructureisusuallyeliminated.AndSDSconfersthepolypeptidechainauniformnegativecharge.Sometimes,mercaptoethanol

(巯基乙醇)isneedtobreakthedisulphidebond.Thus,theproteinmoleculescanberesolvedbyelectrophoresisinthepresenceofSDS.accordingtothelengthofindividualpolypeptide.Afterelectrophoresis,theproteinscanbevisualizedwithastain,suchasCoomassiebrilliantblue(考马氏亮蓝).ProteinsfromthePAGEgelcanbetransferredtoamembrane,followedbyaWesternBlotanalysisofthetargetproteinbyacorrespondingantibody.WesternBlot(蛋白质印迹)WesternBlot

原理：经过SDS分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检察电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。研究步骤：蛋白样品的制备；经过SDS分离样品；分离的蛋白转移到膜载体上，转移后首先将膜上未反应的位点封闭起来以抑制抗体的非特异性吸附；用固定在膜上的蛋白质作为抗原，与对应的非标记（一抗）结合；洗去未结合的一抗，加入酶偶联或放射性同位素标记的二抗，通过显色或放射自显影法检测凝胶中的蛋白成分。血液透析小分子溶出小分子被带出透析机透析液加压血液透析和超过滤透析按照分子大小进行分离。分离取决于透析袋截留的分子量。透析液浓缩的蛋白混合样品

透析袋

开始透析处于平衡状态60000~80000转/分重力60万～80万倍密度梯度离心凝胶过滤2DPAGEgelelectrophoresis2DPAGEgelelectrophoresis2DPAGE亲和色谱颗粒具有极强的专一性AffinitychromatographyAffinitychromatography蛋白质的纯化对其功能研究极为重要蛋白的纯化主要依据：分子量大小、所带电荷、形状等指标（size,chargeshape）2.蛋白质纯化(Proteinpurification)柱层析法（Columnchromatography）

分离纯化蛋白的有效手段Inthisapproach,proteinfractionsarepassedthoughglasscolumnsfilledwithappropriatedmodifiedsmallacrylamideoragarosebeads.Columnchromatography离子交换柱

Ionexchangechromatography1,蛋白根据其表面电荷的差异而被分离（Theproteinsareseparatedaccordingtotheirsurfacecharge.）2,分离柱的珠子被正电荷或负电荷基团修饰（Thebeadsaremodifiedwitheithernegative-chargedorpositive-chargedchemical