免疫组化常用方法

免疫组化常用方法二步法：EnVisionSystemEnVision显色系统是将二抗和酶通过一个多聚葡聚糖骨架联接成一个多聚体（即EnVision）直接放大信号40-50倍，把传统的二抗、三抗分别孵育合为一次孵育。特点：敏感、省时、方便、背景低（避免了内源性生物素干扰）。EnVision工作程序：1） 脱蜡、水化组织切片。2） 预处理组织切片（据一抗具体说明而定）3） 蒸馏水漂洗，置于TBS中。4） 阻断内源性过氧化物酶（仅用于EnVisionTM/HRP）5） 蒸馏水漂洗，置于TBS，10分钟6） 一抗孵育10-30分钟7） TBS漂洗10分钟8） EnVisionTM孵育10-30分钟9） TBS漂洗10分钟10） 色源底物溶液孵育10分钟11） 蒸馏水漂洗12） 复染及封片免疫染色方法ThebasicprinciplesofICC•抗原抗体反应-标记化学反应•呈色化学反应要求待检标本形态结构和抗原性保存良好，抗原不从原位扩散或丢失Specimenpreparation取材新鲜，固定及时，形态保存完好，抗原物质的抗原性不丢失、不扩散和被破坏FixationSampleTypeCryostat(frozen)sectionsParaffinSectionsAntigenRetrievalTechniquesIntention:Tofacilitatetheimmunologicalreactionofantibodieswithantigens(increasereactivityofthemajorityofantigens).AntibodyStainingPrimaryantibodymaybedirectlylabeledlabeledsecondaryantibodyormorecomplexdetectionsystem.secondaryantibodyagainsttheimmunoglobulinsoftheprimaryantibodysource减少或消除非特异性染色的方法•最常见原因蛋白吸附于高电荷的胶原和结缔组织成分上•最有效方法在用第一抗体前加制备第二抗体动物之非免疫血清(1:5-20)10-20min，加入2-5%牛血清白蛋白可进一步减少非特异性染色，用除制备第一抗体以外的其它动物血清(非免疫的)对照实验主要是针对第一抗体对照，常用方法：•阳性对照：已知阳性•阴性对照：已知阴性空白对照BS代替特异性抗体替代对照:用同种属正常血清代替特异性抗体吸收实验:先用抗原吸收一抗抑制实验:先用未标记抗体,再用标记抗体置换实验:用无关的特异性抗体代替一抗AntibodyDetection•Thereareseveraldifferentmethodsthatcanbeemployedtodetectantibodiesboundtotissue,dependinguponwhetherthelabelusedisenzymaticorfluorescent.FluorescenceEnzyme-MediatedDetection亲和组织化学(Affinityhistochemistry)FluorescenceDirectlyIndirectly直接法间接法补体法双标法使用荧光显微镜的注意事项•暗室•点燃汞灯5-15min,稳定后再开始观察•光源寿命有限，应集中观察，防止反复点燃，灯熄后应充分冷却才能再次点燃，一次观察时间不能太长，以2-3h内为宜•标本染色后应尽快观察,存放在4C能延缓荧光衰减，标本不能长时间暴露于紫外线荧光显微镜标本制作要求载玻片:厚度均匀,0.8-1.2mm之间，光洁，无自发荧光盖玻片:厚度0.17mm,光洁标本:不能太厚封裱剂:无自发荧光，无色透明,pH8.5-9.5,常用甘油和0.5mol/LpH9.0-9.5碳酸盐缓冲液等量混合镜油:无荧光镜油，或甘油或液体石蜡Enzyme-MediatedDetection直接法(Direct)间接法(Indirect)基本原理-以间接法法为例-一抗是对组织细胞内某种抗原的特异性抗体(80-90%多抗由家兔制得，单抗由小鼠制备)-二抗为一抗(IgG)的抗体。-优点：只要一抗来自同一种属，同一标记的二抗就能用来显示不同的抗原，避免了直接法标记每一种一抗，提高了敏感度。酶标抗体法的特点-用于标记的酶应具备以下几点：酶催化的底物必须是特异的，且容易被显示，易于光、电镜观察所形成的终产物必须稳定，不能弥散较易获得，价廉，最好已商品化组织中不应存在内源性酶或类似物质酶应稳定,标记后保持酶和抗体的活性缺点酶与抗体共价结合损害部分抗体和酶的活性三步法(HRPlabelled)多层反应法AlkalinePhosphatase-Anti-AlkalinePhosphatase(APAAP)Technique过氧化物酶抗过氧化物酶法(PeroxidaseAntiperoxidase,PAP法)-原理与酶桥法相似-制备PAP复合物：使抗HRP抗体与HRP形成可溶性复合物PAP复合物的特征-在抗原稍过量时,所有抗HRP抗体均参与形成可溶性PAP复合物-PAP复合物的形状相当稳定，不受抗原量的影响-PAP复合物中HRP/抗HRP抗体的比例为3:2,即由3个HRP分子与2个抗HRP抗体组成，呈五角形结构PAP法的评价•抗体活性高:非标记抗体酶法最大限度地保存了抗体活性-灵敏度高：3个酶分子对应1个抗原•不适合免疫电镜AP复合物分子量大•背景染色低假阴性及其处理假阳性及其处理组织细胞内色素：如神经黑色素，可用AKP代替HRP假过氧化物酶活性：如RBC内的血红素辅基,用甲醇-0.3%H2O2预处理15-20min(室温)内源性过氧化物酶活性：如粒细胞、巨噬细胞等，用AKP代替HRP游离醛基：与蛋白质(含IgG)非特异性结合，用白蛋白预孵育封闭之疏水键和离子键：Ig可通过疏水键和离子键与组织中的碱性蛋白或Fc受体非特异性结合，用正常血清(首选制备二抗的种属)于一抗前孵育封闭之天然抗体及不纯抗体：增加一抗稀释度载体蛋白抗体：制备半抗原的抗体时，使用了载体蛋白，用固相吸收技术将载体蛋白抗体除去增加染色强度方法重复显色重复一抗双桥PAP法亲和组织化学(Affinityhistochemistry)•新技术的出现----新进展•特点一些具有双价或多价结合力的物质如植物凝集素(Lectin)、生物素(Biotin)和葡萄球菌A蛋白(Staphylococcalprotein,SPA)等被应用于ICC，其共同特点是以一种物质对某种组织成分具有高亲和力为基础。它们既有别于古老的组织化学的分解、置换、氧化和还原，本质上又非抗原抗体反应。称为亲和组织化学(Affinityhistochemistry)。广义的亲和组织化学包括：抗原与抗体、植物凝集素与糖类、生物素与抗生物素、SPA与IgG、阳离子与阴离子、配体与受体等。Avidin-Biotininteractionsorothercommercially-availableamplifiers生物素-抗生物素基本原理Avidin卵白素，统称为抗生物素或亲和素abasicglycoprotein，MW68Kdbiotin生物素，smallwatersolublevitamin(vitaminH),MW24Kd,-Avidin(卵白素)具有4个同biotin(生物素)亲和力极高(较抗原抗体高100万倍)的结合点。能够彼此牢固结合而不影响彼此的生物学活性。同时它们都具有与其它示踪剂结合的能力。抗生物素-生物素-过氧化酶复合物技术(AvidinBiotin-PeroxidaseComplextechnique,ABC技术)ABC法的评价advantages敏感性强:亲和力强特异性强:一抗和二抗工作浓度低时间缩短多重标记注意事项内源性生物素活性:如肝、肾、白细胞、脂肪组织和乳腺，预先用0.01%的抗生物素和0.01%生物素分别作用20min，每次作用后PBS5minX3次差异大，注意厂家、批号3.4C保存DisadvantagesofABCABC的IP约为10,中性pH时带正电荷,容易与nucleus等带负电荷结构非特异结合.Avidin是glycoprotein,与lectins等分子通过碳水化合物连接•通过用streptavidin(抗生蛋白链霉素)代替avidin克服上述缺陷.Streptavidin:aprotein(MW60Kd)isolatedfromthebacteriumStreptomycesavidinii(链霉亲生物素蛋白)，andlikeavidin,hasfourhighaffinitybindingsitesf