肽类或蛋白质类药物体内衰老的研究进展

肽类或蛋白质类药物体内衰老的研究进展

随着工程技术的快速发展和生物科学与化学等学科技术的紧密结合，醇类和蛋白质类药物逐渐成为药物研发和临床治疗的热点。2004年,国际上销售额排名前200的药物中有20%属于多肽、蛋白质或抗体。从2006年到2010年,美国FDA批准99种新分子实体药物上市,其中有21%为生物类药物。2011年,生物医药市场销售总额接近1400亿美元,其中重组蛋白质或抗体药物占71.4%;美国或欧洲批准上市的430种生物类药物中重组蛋白质或抗体药物占69.8%。有研究表明,预计到2013年全世界肽类或蛋白质药物销售总额达1600亿美元,这一数据还将每年以7%~15%增加。目前,绝大多数肽类和其类似物的药物为激素或具有激素作用的肽衍生物,虽然具有较强的生物学活性,但在体内发挥药理学作用时,也具有以下限制因素:(1)口服利用度低,通常选用注射给药方式;(2)亲水性强,不易通过生理屏障;(3)较高的构象灵活性,有时与受体和靶标进行结合时缺乏特异选择性,易导致副作用。除以上的因素,还有一个最为主要的限制因素为其在体内半衰期较短。一些肽或蛋白质类药物的体内半衰期仅有几分钟,从而导致到达靶组织的药物浓度过低,不能发挥足够的药效,严重限制其临床应用。半衰期较短一般有两方面原因造成,一是在血浆、肝脏和肾脏中存在着大量的肽酶(peptidase)和蛋白酶(protease),肽或蛋白质在酶的作用下迅速降解;二是在血浆中分子质量较小的肽类或蛋白质类药物(低于50ku),由于肾脏的过滤作用而被快速排出。延长肽类或蛋白质类药物的半衰期,不但可以改善药物的药代动力学和药效学特征,而且可以减少用药量和用药次数,而这也是现在肽类或蛋白质类药物临床应用上的难题。目前,已经开发出一系列的延长肽类或蛋白质类药物半衰期的方法,如提高肽类或蛋白质类药物对酶的稳定性来减少酶的降解;或者通过增加肽类或蛋白质类药物的流体力学体积(hydrodynamicvolume)和FcRn介导的再生作用来减少肾脏过滤排出(Fig1)。本综述将根据不同延长半衰期的方法策略进行分类,并分别就不同的方法进行举例和归纳。1提高酶的稳定性对肽类或蛋白质类药物进行修饰,可以提高对酶的稳定性,是延长肽类或蛋白类药物半衰期的一种策略。1.1glp-1-peptica1的活性在血清、肝脏和肾脏中有多种影响肽类或蛋白质类药物稳定性的外肽酶(exopeptidases),因此对其C-/N-端进行修饰可以在一定程度上提高对酶的抗性,一般末端修饰方法为N端乙酰化(N-acetylation)和C端酰胺化(C-amidation)。GLP-1(glucagon-likepeptide1)是一种葡萄糖依赖的促胰岛素分泌肽(glucose-dependentinsulinotropicpeptide,GIP),其具有两种活性形式,GLP-1(7-36)酰胺和GLP-1(7-37)。GLP-1在体内能促进胰岛β细胞分泌胰岛素,抑制胰高血糖素的分泌,控制血糖,是有效治疗2型糖尿病的多肽激素,但其在体内受到二肽基肽酶Ⅳ(dipeptidylPeptidaseIV,DPP-IV)的降解,其半衰期仅2min左右,临床应用时需要高剂量频繁注射,严重影响其作为药物的潜力。将GLP-1的N端分别进行乙酰化(acetyl)和焦谷氨酸化(pyroglutamyl),发现其半衰期可以延长至12h以上,且具有很强的活性。在GLP-1-Fc融合蛋白的N端分别加上一个Ala或者Gly,形成A-GLP-1-Fc和G-GLP-1-Fc,半衰期由11.8h分别延长至13.5、13.7h。1.2生长素抑制剂对蛋白的酶敏感位点进行氨基酸替换,可以有效地降低酶的降解,延长半衰期。DPP-IV能特异性切割GLP-1的His-Ala,用D-Ala替换Ala,则可以明显提高对DPP-IV的抗性,而其生物活性与GLP-1类似,使其在体内发挥作用的时间比GLP-1至少长30min。生长素抑制剂(somatostatin)是一个抑制胰腺内分泌和外分泌的十四肽,其半衰期仅几分钟,限制了其临床应用。octreotide是对somatostin酶敏感的氨基酸位点进行替换、删除等修饰后得到的多肽,从十四肽缩短到八肽,用D-氨基酸替代L-氨基酸,半衰期得到了较大提高,从几分钟延长至1.5h。Cetrorelix为一种促黄体激素释放激素(luteinizinghormonereleasinghormone,LHRH)的十肽拮抗剂,其中有5个氨基酸被D-氨基酸替换且C端酰胺化,能在37℃下对一些蛋白酶(如胰凝乳蛋白酶和链霉蛋白酶)有极强的抵抗力,其半衰期可达62.8h。1.3agrf1-29-nh2的制备将肽或蛋白质进行环化也是一种提高酶稳定性,延长半衰期的有效策略。将生长控制因子(growthregulatingfactor,GRF)及其类似物同时在猪血清(porcineplasma)中37℃温育,结果GRF(1-29)-NH2半衰期只有13min,而将Asp8的侧链与Lys12的侧链间进行环化,其半衰期可达2h以上。Marastoni等将制备了6个氨基酸的线性的和首尾环化的T肽类似物,结果所有的复合物都有高的活性且极大的提高了在血清和脑中的稳定性。2增大分子量的影响血液中小分子肽类和蛋白类药物易被肾脏过滤而排出,因此增大分子量使其超过肾脏过滤的临界值(40~50ku)是延长半衰期的重要策略,此类方法主要包括将肽或蛋白与大分子相连,如PEG、Albumin或IgG等。2.1peg分子与glp-1的连接PEG药物修饰(PEGylation)是一种将蛋白质、肽或非肽分子类药物与一个或多个PEG分子化学偶联,从而增加药物在体内半衰期的一种方法。PEG修饰增加蛋白质和肽类药物的稳定性,提高可溶性,降低免疫原性,延长在血液中的滞留时间,减少蛋白酶的降解,从而降低用药频率。1990年,第1个经PEG修饰的牛腺苷脱氨酶(adenosinedeaminase,ADA)Adagen获得美国FDA批准上市,用于治疗重症综合性免疫缺陷病(severecombinedimmunodeficiencydisease,SCID)。PEG修饰技术经过20多年的发展,现在已经可以应用一系列的化学或者酶促方法将不同的蛋白质药物与不同数量的PEG分子偶联。PEG分子主要与蛋白质的氨基(aminogroup)、巯基(thiol)、羟基(hydroxyl)和酰胺基团(amidegroup)等连接,组氨酸标签和二硫键也可以用来与PEG分子偶联。Lee等用2ku的单PEG分子与GLP-1的Lys26或Lys34偶联,制成PEG2k-LysGLP-1分子,将其静脉注射进老鼠体内,其半衰期为33min,比非PEG修饰GLP-1提高16倍。PEG修饰的GLP-1具有较高的稳定性,主要源于PEG分子引起的空间位阻效应。目前,已被批准上市多种PEG修饰的蛋白质药物,涉及酶、细胞因子和抗体,如asparaginase、interferon-α2b(INF-α2b)、granulocyte-colony-stimulatingfactor(G-CSF)、humangrowthhormone(hGH)、erythropoietin(EPO)和一个Fab片段。在这些药物中,用不同的方法将一条或几条分子质量为5~40ku的PEG链与蛋白质随机或特定位点交联。一个典型的例子是PEG修饰的interferon-α2a(Pegasysue4d2),美国FDA于2001年批准用于治疗丙型肝炎。对患者进行皮下注射后,无PEG偶联的interferon-α2a半衰期是3~8h;而interferon-α2a的4个赖氨酸(Lys31、Lys121、Lys131和Lys134)分别与1个40ku并带有分支的PEG分子进行偶联后,其半衰期达到65h,约提高18倍,且没有免疫原性。半胱氨酸在蛋白质和肽中并不常出现,因此在不参与形成二硫键的半胱氨酸巯基上进行PEG修饰成为一种重要的方法。最近,Balan等研究出一种新型的PEG交联方法,可以直接将PEG分子连接到IFN(Interferonα-2b)二硫键上,利用双烷基化PEG试剂将还原后的IFN二硫键(Cys29-Cys138、Cys1-Cys98)的两个巯基分别烷基化形成三碳桥,PEG通过三碳桥与蛋白质共价偶联。这种三碳桥能够稳定蛋白质结构,将IFN的半衰期从1h延长到12h,且不影响生物活性。另外,基因工程的发展可将蛋白质或者肽链任意位置的非重要氨基酸突变为半胱氨酸,再与PEG偶联。certolizumabpegol(Cimziaue4d2)是一种通过Fab’末端游离的巯基与40kuPEG连接的药物,有抗肿瘤刺激因子alpha(antiTNF-α)功能,用于治疗克罗恩病(Crohn’sdisease)。皮下注射后,certolizumabpegol在人体内半衰期为14d,相比Fab(其半衰期12~18h),其半衰期大大延长。2.2ctp的加入和对大鼠血浆保水性的影响许多蛋白质都带有N-/O-连寡糖链,研究发现,这些糖基能够影响蛋白质的半衰期。因此可以通过对蛋白质的特定位点进行糖基化,引入额外的N-/O-连寡糖链延长蛋白质药物的半衰期,现在已有几种蛋白质药物通过糖基化而延长了其半衰期。人绒毛膜促性腺激素β(humanchorionicgonadotropinbeta,HCGβ)亚基有一个28个氨基酸的CTP(carboxyl-terminalpeptide,CTP),CTP上有4个O-连寡糖链。利用定点突变的方法将CTP去掉,发现对受体的结合没有影响,但是却明显降低活性和缩短半衰期。研究发现,寡糖链末端的唾液酸(sialicacids)可能是延长蛋白质半衰期的重要因素。同时,携带越多负电荷的糖蛋白其半衰期越长,这可能与减少了肾小球的滤过有关。因此,将带有唾液酸化O-连寡糖链的CTP加入到其他激素的末端,是延长半衰期的一种策略。人生长激素(humangrowthhormone,hGH)是治疗儿童生长障碍的重要药物,但是其半衰期较短(在人体内12min)。在hGH两端加上CTP,形成CTP-hGH-CTP-CTP复合物,将该复合物分别静脉注射和皮下注射入大鼠体内,其半衰期分别为6.9h和9h,比biotropin(一种重组hGH药物)长4~5倍,且CTP对活性并无影响。促卵泡生成素(follitropin-stimulatinghormone,FSH)可应用于辅助生殖技术,将CTP加到FSH的C端,形成FSH-CTP复合物,在人体内其半衰期可以达到78.5~120.9h,比Puregon(重组FSH)长2~3倍,且不影响与受体的结合,免疫原性较小。目前,FSH-CTP已被批准上市。CTP易连接到许多蛋白质药物的两端,可以稳定蛋白质,延长半衰期,且没有毒性,生物活性不会丢失,因此,连接CTP是一种延长肽类或蛋白类药物较好的方法。另外,通过基因突变的方法也可以在蛋白质内引入寡糖链。重组EPO(recombinanthumanEPO,rhuEPO)在临床上用于治疗贫血症。但rhuEPO面临的主要问题是其半衰期仅有8h,需频繁注射。红细胞刺激蛋白dabepoetinalfa(Aranespue4d2,作用与EPO相似)是在EPO基础上对30和88位进行突变后连接了两个N-连寡糖链的产物,静脉注射后体内半衰期为25h,是rhuEPO的3倍。而另一种策略,CTP加在EPO的C端,也可将半衰期增加2~3倍。利用基因突变的方法在IFN-α氨基酸序列中引入4个糖基化位点,半衰期比无糖基化IFN-α的可延长25倍。2.3x费用诱导氨基酸在大肠杆菌中的表达随着基因工程技术的发展,用一条亲水性和柔和性强的肽链代替PEG与肽类或蛋白质类药物进行连接,可以极大的延长半衰期。这个过程可以通过基因融合技术实现,从而避免了化学交联和额外的纯化步骤,并且连接的肽链在体内可以完全降解。Amunix公司最近研发了一种XTEN技术,该技术依赖于由Ala、Glu、Gly、Pro、Ser和Thr6种氨基酸组成的不同长度的肽链,无特定构象,称为XTEN序列。将肽或蛋白质药物与XTEN序列以基因融合方法进行连接,能增加前者的可溶性和稳定性,且具有低免疫原性、产物纯度高和能够完全生物降解的特点。exenatide是一个由39个氨基酸组成的肽,其作用类似于GLP-1,能治疗2型糖尿病,其分子质量较小,易被肾脏清除,在人体内的半衰期只有2.4h,需每天注射两次。将编码864个氨基酸肽链基因融合到exenatide基因的3’端,大肠杆菌中成功表达Exentide-XTEN864融合蛋白,皮下注射食蟹猴(cynomolgusmonkeys,5kg)发现,其半衰期延长至60h,且保持了80%的生物活性;为估算在人体内的半衰期,分别用小鼠(0.025kg)、大鼠(0.25kg)和狗(12kg)进行实验,得到标准曲线,从而推断出在75kg的人体内的半衰期为139h。若一次性注射100mg,可有效控制血糖至少30d。该药物目前已经进入临床Ⅰ期研究阶段。因此,XTEN技术是一种可以使肽类药物半衰期延长的有效方法。XL-protein公司利用重复的Pro、Ala和Ser构建了无规则卷曲的蛋白结构,这种技术称为PASylation;用上述3种氨基酸组成了200~600个氨基酸残基的PAS序列,并通过基因融合的方法将蛋白质或肽类药物与之连接,增大了体积,从而阻止了肾脏的快速滤过,延长了半衰期。目前,已将此PAS序列与Growthhormone、Interferon和Fab片段连接,可使其半衰期延长10~100倍。Schlapschy等利用富含Gly的同源氨基酸聚体(homo-amino-acidpolymers,HAP)(Gly4Ser)n形成无规则卷曲的长链,可以与肽或蛋白质结合延长其半衰期。如将(Gly4Ser)40与Fab形成融合蛋白,能将Fab的半衰期从2h延长到6h,且其活性没有受到HAP链的影响。3sa和igg-fc的机制人血清白蛋白(humanserumalbumin,HSA)和IgG是人体血液中的两种含量最丰富的蛋白质,占血浆总蛋白含量的80%-90%,且其具有较长的半衰期,可分别达19d和21d。研究发现,半衰期较短的肽类或者蛋白质类药物可以通过与HSA或者IgGFc片段通过化学交联或者基因融合的方法相连,从而明显延长其半衰期。通过HSA和IgG延长半衰期主要有两个方面的原因,一是HSA和IgG明显增加肽类或者蛋白质类药物的体积,降低肾脏的快速清除;二是在血液中,HSA和IgGFc能够通过新生儿Fc受体(neonatalFcreceptor,FcRn)介导的再生作用来延长半衰期。FcRn是一种膜蛋白受体,其主要负责转运母体IgG向新生儿血液中,使新生儿获得免疫力;FcRn主要存在于上皮细胞和内皮细胞,但在肝脏、肾脏和肠细胞也有分布。在血液中,HSA和IgGFc能够与FcRn以一种pH依赖的方式结合,即IgG和Albumin经胞吞作用被细胞吸收后,在内涵体的酸性环境中与FcRn结合,既可免受溶酶体的降解,又可在生理pH时释放并重新返回到血浆中,从而明显延长半衰期。3.1glp抑制剂的使用HSA是血液中含量最多的蛋白质,分子质量为67ku,由肝脏合成,其半衰期为19d。现已有多种蛋白质或者肽与HSA结合而大大延长了体内半衰期(Tab1)。肽及蛋白质与HSA连接主要通过两种途径:化学交联或融合基因表达。化学交联是指肽与HSA表面Cys34的巯基以共价键的方式进行连接。如CJC-1134-PC是Exendin-4通过羧基端与HSACys34连接,使Exendin-4的半衰期由2.4h延长至8d。基因融合技术可将肽或蛋白质连在HSA的氨基端或羧基端,形成一个体积较大、不容易被肾脏过滤清除的融合物,从而延长半衰期。目前已利用基因融合技术与HSA连接的生物类制剂有GLP-1、interferonα2b、白介素2(interleukin-2)和粒细胞集落刺激因子(granulocyteColony-StimulatingFactor,G-CSF)。liraglutide(Victozaue4d2)也是一种治疗糖尿病的肽类药物,其构造为GLP-1(7-37)Lys34替换为Arg,一个16个碳的脂肪酸链,通过Glu与Lys26相连,皮下注射后脂肪酸链可以与血浆中的Albumin结合,其半衰期延长为13h,可以在24h之内有效控制血糖。albiglutide是一种GLP-1受体激动剂,是将两个重复的GLP-1(7-36)分子连接到HSA上,并且将GLP-1(7-36)的Ala8替换成Gly,以防止DPP-IV的酶切,将GLP-1的半衰期从2min延长到6~8d。Albuferonue4d2是由interferonα-2b与HSA融合后形成的融合蛋白,人体内半衰期可达6d,而无融合的interferonα-2b半衰期仅有2~3h。Ⅲ期临床试验证明,在治疗丙肝(hepatitisC)方面,每两周注射1次此种融合蛋白的效果不逊于PEG修饰的interferonα-2b,这也提供了一种可选择的治疗方法。将白介素2与Albumin进行融合表达形成融合蛋白Albuleukin,在小鼠体内其半衰期由原来的19~57min延长到6~8h,并且能有效的抑制黑色素瘤和肾细胞瘤。Albugraninue4d2是一种将G-CSF的N端融合到HSAC端所形成的融合蛋白,在小鼠体内半衰期为5.6~5.7h,是G-CSF(2.5h)的2.3倍。3.2与fc融合的蛋白类药物免疫球蛋白亚类IgG1、IgG2和IgG4在体内的半衰期为2~3周,且能与多数肽类和蛋白质类药物连接,因此非常适合作为延长肽类或蛋白质类药物半衰期的载体。Fc片段是由两条完全相同的IgG重链(包括CH2和CH3区域)组成,分子质量为50ku,可通过基因融合方