b第六章植物基因工程上

基因工程第六章植物基因工程（上）湖南科技大学生命科学学院第六章植物基因工程（上）一、植物的转基因技术植物细胞培养技术植物转基因技术的基本路线转基因的受体系统外源基因导入植物的方法二、转基因植物的筛选与检测报告基因分子生物学检测方法转基因植物转基因植物（transgenicplant)：指利用基因工程技术，在离体条件下对不同生物的DNA进行加工，并按照人们的意志和适当的载体相连，在将重组DNA转入生物体或细胞内，并使其在生物体或细胞内表达的植物。转基因植物通常具有高产优质、抗病虫、耐寒、抗高温、提高某些成分含量等优良性状。转基因植物的种植，将会带来全球种植业的“第二次绿色革命”。一、植物的转基因技术1939年white和Gatheret用实验方法培养植物组织和器官以来，经过不断的发展，植物细胞和组织培养技术已经发展成为一门精细的实验科学。植物的体细胞具有全能性：即单个细胞经过合适的培养，通过愈伤组织器官分化或体细胞胚胎分化途径再生出完整的植株。一般先通过植物激素等调节、诱导植物细胞进行分裂，获得再生的愈伤组织，通过激素诱导可获得再生的植株。（一）植物细胞培养技术（一）植物细胞培养技术植物细胞的全能性（二）植物转基因技术的基本路线分离目的基因；将目的基因克隆到适当的载体上形成重组DNA；利用细菌繁殖扩增重组DNA;利用基因枪、农杆菌等方法将重组DNA导入到目标植物的细胞中；筛选含有外源基因的转化细胞，诱导产生转基因植株；转基因植株大规模种植。植物转基因技术的基本路线（三）转基因的受体系统植物组织受体系统；植物细胞原生质体系统；生殖细胞受体系统;叶绿体转化系统。1.植物组织受体系统受伤的细胞容易受到病毒或质粒的感染，这些病毒或质粒通过不同的方式转移到植物细胞，并形成愈伤组织。愈伤组织可以培养成完整的转化植株。该受体系统转化率高，可获得较多的转化植株，取材广泛，适应性强。但再生植株无性变异较大，转化的外源基因稳定性差。2.植物细胞原生质体系统原生质为植物细胞去壁后的部分，具有全能性。原生质体在体外较易完成一系列细胞或遗传操作，可以直接高效捕获外源基因。但转基因植株稳定性差，培养周期长，难度大，再生频率低。2.植物细胞原生质体系统植物原生质体的制备3.生殖细胞受体系统是以植物生殖细胞，如花粉细胞、卵细胞为受体进行基因转化的系统。一是利用组织培养技术进行花粉细胞和卵细胞的单倍体培养，形成愈伤组织，进一步分化成单倍体植株，建立单倍体的基因转化系统；二是利用花粉和卵细胞受精过程进行基因转化，如花粉管导入法、花粉粒浸泡法等。具有全能性的生殖细胞为受体细胞，具有更强的接受外源DNA的潜能，缺点是该系统转化受季节限制，只能在开花期进行，且不适用无性植物。4.叶绿体转化系统外源基因可以在叶绿体中稳定表达，且叶绿体作为外源基因的转化受体又有很多的优越性：

便于外源基因的定位整合；

基因为多拷贝，表达量高；

导入的外源基因性状稳定性高、安全性好；

能直接表达原核基因。（四）外源基因导入植物的方法DNA直接转移法：化学刺激法；电击法；显微注射法；基因枪法；脂质体介导法；微激光束法；花粉通道法2.载体介导法：农杆菌介导法；植物病毒DNA介导法。DNA直接转移法是指通过物理化学法将外源基因直接转入受体植物细胞的方法。最大的特点是无宿主范围，外源DNA进入宿主细胞，最终整合到植物基因组中。该法特别适用于单子叶植物。A.化学刺激法植物细胞的原生质体经过某些化学药品（PEG、PNA、磷酸钙、氯化钙）处理后，能够捕获外源DNA。此法对细胞伤害少，易于选择转化体，受体植物不受种类限制。在适当的外加电压下，细胞膜可能被击穿，但不影响或很少影响细胞质的生命活动，移去外加电压后，膜孔在一定时间内可以自动恢复，细胞膜这种可逆性的变化使得溶液中的大分子物质（DNA）进入细胞。可逆击穿的临界电压、脉冲时间长度、温度、PEG的浓度和处理时间、细胞类型等都影响到转化的频率。B.电击法在适当的外加电压下，细胞膜可能被击穿，但不影响或很少影响细胞质的生命活动，移去外加电压后，膜孔在一定时间内可以自动恢复，细胞膜这种可逆性的变化使得溶液中的大分子物质（DNA）进入细胞。可逆击穿的临界电压、脉冲时间长度、温度、PEG的浓度和处理时间、细胞类型等都影响到转化的频率。C.显微注射法D.基因枪法利用带有外源DNA的金粉或钨粉微粒经过放电或机械加速后对细胞射击。其过程为先用CaCl2、亚精胺或聚乙二醇沉淀外源DNA，然后将外源DNA与球状钨、金等金属颗粒共同温育，使DNA吸附于金属表面，再利用基因枪加速包裹了外源DNA的颗粒，使之穿过细胞壁及细胞膜，进入受体细胞。转化受体迅速、简单、取材广泛、植株可育性高等优点，但有转化效率低、仪器昂贵、不易获得再生植株等缺点。D.基因枪法基因枪法用于植物细胞的转化E.脂质体介导法脂质体为人工构建的磷脂双分子层组成的膜结构，包裹在脂质体内的外源DNA可免受酶的降解。当脂质体与植物原生质体共温育时，脂质体内的外源DNA通过融合或吞噬作用高效率地转运到原生质体细胞质和细胞核内。该法转化效率高，适用植物种类广，重复性高，简单易操作。但局限性在于只能用在有原生质体再生出植株的植物。F.微激光束法利用激光微束脉冲引起细胞膜可逆性穿孔，从而将外源DNA导入受体细胞。先在荧光显微镜下找到合适的细胞，然后用激光光源替代荧光光源，使目的细胞的细胞壁被激光微束脉冲击穿，外源DNA进入受体细胞。G.花粉通道法法是将外源DNA片段在自花授粉后的特定时期注入柱头或花粉，外源DNA沿花粉管通道或传递组织通过珠心进入胚囊，转化不具备正常细胞壁的受精卵、合子及早期的胚体细胞。参与了被转化植物的生殖过程，直接操作于整体植株，避免了传统的基因枪法和土壤杆菌转化法所要求的组织培养技术，转化方法简单、易操作，育种时间短。但此方法仍存在争议，一些理论问题未得到合理的解释。载体介导法是指通过农杆菌或植物病毒介导感染受体植物，将外源基因转入植物细胞的技术。主要包括Ti质粒及植物病毒DNA介导法。A.农杆菌介导法农杆菌介导法构建转基因植物A.农杆菌介导法1、为根瘤土壤杆菌提供附着与植物细胞壁的能力；2、参与寄主细胞制造植物激素（生长素和分裂素）的能力；3、决定所诱导的肿瘤的形态特征和冠婴碱成分；4、赋予寄主菌株对土壤杆菌所产生的细菌素的反应性；5、决定宿主菌株的植物寄主范围；6、具有对噬菌体的排外性，抑制噬菌体的生长与发育。Ti质粒的遗传特性Ori区：控制质粒的自我复制T-DNA区：农杆菌感染植物细胞时，从Ti质粒上切割下来转移到植物细胞的一段DNA，也称转移DNA。随机整合到植物基因组位点上。vir区：该区段上的基因能激活T-DNA的转移，使农杆菌显出毒性，也称为毒区。Ti质粒的结构T-DNA的长度在12-24kb间，在其5’及3’端都有真核表达信号，如TATAbox