灵芝三萜类化合物对AD模型大鼠脑组织保护作用的研究

灵芝三萜类化合物对AD模型大鼠脑组织保护作用的研究【摘要】目的：观察灵芝三萜类化合物对AD模型大鼠海马组织形态的影响。方法：70只大鼠随机分为生理盐水组，假手术组，模型组，溶媒组，GLT低、中、高剂量组；除生理盐水组和假手术组外，其余各组大鼠单侧海马内一次性注射Aβ25-35制作AD大鼠模型，术后生理盐水组、假手术组、模型组大鼠分别灌胃生理盐水，溶媒组灌胃食用油，GLT各组分别灌胃低、中、高剂量的GLT20d，然后采用透射电镜观察海马神经元的超微结构变化。结果：GLT能明显改善模型大鼠脑组织海马CA1区神经元的退行性变化。结论：GLT能改善大鼠海马CA1区神经元的退行性变化。

【关键词】灵芝属；阿尔茨海默病；海马；丙二醛；显微镜检查，电子，扫锚透射；大鼠，Sprague-Dawley

［Abstract］Objective:ToobservetheprotectiveeffectsoftriterpenoidsfromGanodermalucidum(GLT)onthemodalityofhippocampustissueofAlzheimerdisease(AD)modelrats．Methods:ADratsinducedbyinjectionofAβ25-35intoonesideofhippocampusweretreatedwithGLTorallyfor20daysandthenultrastructuralchangesofneuronswereobservedundertransmissionelectronmicroscope．Results：ThemodalityofhippocampusCA1regionneuronsofGLTtreatedADratswasdistinctlyimprovedwhencomparedwiththatofthemodelratsthatdidnotreceiveGLTtreatment．Conclusion:GLTcanimproverecessivelychangedneuronsinhippocampusCA1region．

［Keywords］Gardenia;Alzheimerdisease;hippocampus;malondialdehyde;microscopy,electron，scaningtransmission;rats,sprague-dawley

阿尔茨海默病(Alzheimerdisease,AD)是一种渐进性神经退行性疾病，其病理改变为大脑皮质萎缩,皮质神经元减少,大脑皮质和海马中可见大量神经元纤维缠结(NFT)和老年斑(SP)，即脂褐素。AD临床表现为近期记忆力降低,继而表现持续性智能衰退、运动障碍等。据研究发现脑内胆碱能传递功能紊乱、自由基损伤、β-淀粉样蛋白沉积、神经元凋亡等因素可能在AD的发病机制中起关键性作用。Aβ沉积是AD发病过程中的关键性因素之一已基本得到了公认。GLT存在于赤芝子实体和孢子粉中，有抗氧化、抗衰老等药理作用[1]，本实验采用形态学方法，探讨GLT对Aβ25-35所致AD大鼠的防治作用及机制，为临床治疗AD提供依据。

1材料和方法

1．1实验材料

SD大鼠，雄性，体重g由贵阳医学院实验动物中心提供，合格证号SCXK2002-50001。Aβ25-35购自Sigma公司；DYT2E脑立体定位仪购自天津医疗器械研究所。灵芝三萜类化合物用食用油配制成相应浓度，常温保存。健脑胶囊是青岛国风药业股份有限公司产品。

1．2方法

70只大鼠随机分为7组，生理盐水组(生理盐水10ml/kg)、假手术组(生理盐水10ml/kg)、模型组(生理盐水10ml/kg)、GLT低、中、高剂量组。参考Sharma等的方法，大鼠经10％水合氯醛(g/kg)腹腔注射麻醉后固定于大鼠脑立体定位仪上，侧脑室注射进针坐标为：前囟后，中线左侧2mm，自颅骨表面深3mm。除假手术组和生理盐水组外，其余各组动物均微量注射2μlAβ25-35缓慢注入，留针5min；生理盐水组注入等体积无菌生理盐水，假手术组钻开颅骨后即缝合伤口。各组动物术后常规注射阿奇霉素连续3d。术后次日按上述剂量灌胃给药，每日1次,连续20d。

1．3大鼠海马CAI区锥体细胞超微结构

实验结束后取大鼠，切开皮肤，钝性分离，找到双侧的颈总动脉，一侧插管，一侧结扎，并剪开一侧的颈外静脉以利于回流，先灌注生理盐水，再灌注戊二醛固定液，固定1h后取脑。取海马CA1区组织1mm3，1％锇酸后固定，环氧树脂包埋，超薄切片，醋酸铀、枸橼酸铅染色，H-600型透射电镜观察、摄片。对切片海马CA1区随机选取若干铜网观察，每只铜网在海马CA1区锥体细胞区域摄片。

2结果

透射电镜下，模型组及溶媒组海马CA1区锥体细胞核膜局部肿胀内质网扩张，核周质线粒体肿胀，大部分嵴消失，粗面内质网颗粒消失，可见脂褐素，有NFT，颗粒空泡变性，核染色质边聚。生理盐水组和假手术组锥体细胞胞浆内可见丰富的线粒体、粗面内质网及高尔基体等细胞器。GLT组锥体细胞线粒体轻度肿胀，内质网轻度扩张，细胞核轻度固缩，核膜清晰。胞质内见较多的线粒体、核糖体及粗面内质网，少量NFT，细胞器尚属正常。

3讨论

AD是中枢神经系统一种常见的进行性神经退行性疾病，其临床表现为进行性记忆力减退，认知能力下降等，其主要病理改变是神经细胞之间存在大量的SP以及神经细胞内存在大量的NFT。海马内注入Aβ25-35造成AD模型大鼠，其学习记忆变化及病理变化贴近AD。本实验依此为基础，进一步研究灵芝三萜类化合物对AD的防治作用。灵芝是我国传统的延年益寿中药，中医理论认为，灵芝具有“益精气，补五脏，滋补强壮，扶正固本”的作用。现代药理学研究证明，灵芝提取物灵芝三萜类化合物有抗氧化、延缓衰老、清除自由基等药理作用，因而使用GLT对阿尔茨海默病的治疗能改善大鼠海马锥体细胞超微结构变化，减少脂褐素堆积，发挥其保护神经细胞的抗氧化作用[6,7]。本实验通过对大鼠单侧侧脑室注射Aβ25-35，大鼠活动量及食量同时减少，皮毛无光泽，水迷宫训练学习记忆能力下降,说明AD模型成功。电镜结果显示，Aβ在大脑内能引起海马锥体细胞的退行性改变及早期凋亡现象，如细胞水肿，细胞核中异染色质呈边集现象，核膜断裂，核间隙增宽，细胞器破坏，结构显示不清，髓鞘水肿排列紊乱，颗粒空泡变性及NFT。氧自由基对神经元超微结构的损害必然导致神经元功能降低，可以表现为胞核和粗面内质网损害，导致蛋白合成机能下降；线粒体受损导致能量代谢障碍；大量增多的脂褐素堆积干扰细胞器几何空间，使得神经元有序性破坏，从而致使神经元衰老死亡。使用GLT后，AD大鼠海马锥体细胞NFT、颗粒空泡变性较前明显改善，细胞水肿减轻，线粒体、高尔基体、核糖体较模型组明显增多，这正好与GLT能改善AD神经元结构的退变相吻合。表明GLT对海马锥体细胞的超微结构退变有明显的改善作用。

【参考文献】

[1]WangG，ZhangJ，MizunoT，eta1．AntitumoractivepolysaccharidesfromtheChinesemushroomSongshanlingzhi，thefruitingbodyofGanodermatsugae[J]．BiosciBiotechnolBiochem，1993(6)：894-900．

SharmaM,Guptatreatmentwithtransresveratmlpreventsintracerebmventricularstreptozotocininducedcognitiveimpairmentandoxidativestressinrats[J].LifeSciences,2002(71):2489-2498.

LingYW，YuanH，LiPCH．ChangesofNOSpositivecellsandastrocytesinratswithmemorydeficitinducedbyβ-amyloidpeptidefragment25-35[J].ChineseJournalofHistochemistryandCytochemistry,2003(1)：36-41．

郭燕君，袁华，张俐娜，等.灵芝多糖对阿尔茨海默病大鼠海马组织形态学及抗氧化能力的影响[J].解剖学报，2006：509-513.

CongZH，LiJR，WangYF，eta1．ThediscussionofresearchofGanodermaLucidumandthetherapyprincipleofChinesetraditionalmedicine[J].MedicalJo