基因重组技术的基本工具

DNA重组技术的基本工具基因工程的概念基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。基因工程的别名基因拼接技术或DNA重组技术操作环境生物体外操作对象基因操作水平DNA分子水平基本过程剪切→拼接→导入→表达结果人类需要的基因产物DNA重组技术的基本工具

限制性核酸内切酶——“分子手术刀”

DNA连接酶——“分子缝合针”

基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”

限制性核酸内切酶——“分子手术刀”分布：主要在原核生物中作用特点：特异性，即识别特定核苷酸序列，切割特定切点切点：磷酸二酯键举例：EcoRI限制酶能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开限制性内切酶限制酶黏性末端和平末端限制酶所识别的序列有什么特点

限制酶所识别的序列，无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条中心轴线，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的。DNA连接酶——“分子缝合针”连接酶有两种：一种是从大肠杆菌中分离得到的，称之为E·coli连接酶。另一种是从T4噬菌体中分离得到，称为T4连接酶。这两种连接酶催化反应基本相同，都是连接双链DNA的缺口，而不能连接单链DNA。E·coli连接酶只能连接黏性末端；T4连接酶既可“缝合”黏性末端，又可“缝合”平末端。DNA连接酶——“分子缝合针”DNA连接酶与DNA聚合酶一样吗？为什么？基因的载体——“分子运输车”载体必须具备的条件：1、能够在宿主细胞中复制并稳定地保存；2、具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接；3、具有某些标记基因，便于进行筛选。（如抗菌素的抗性基因、产物具有颜色反应的基因等）

4、对受体细胞无害载体的作用：1、将外源基因转移到受体细胞中去。2、利用运载体在受体细胞内，对外源基因进行大量复制。常用的载体有：

质粒，λ噬菌体的衍生物，动植物病毒等质粒质粒是基因工程最常用的运载体，它广泛地存在于细菌中，是细菌染色体外能够自主复制的很小的环状DNA分子，大小只有普通细菌拟核DNA的百分之一。要对天然质粒进行人工改造基因操作的基本步骤基因操作的基本步骤归纳:基因工程的基本操作程序获取目的基因从基因文库利用PCR化学方法人工合成构建基因表达载体目的基因、启动子、终止子、标记基因将目的基因导入受体细胞农杆菌转化法、显微注射法目的基因的检测与鉴定检测：是否插入、转录、翻译基因操作的基本步骤提取目的基因

从供体细胞的DNA中直接分离基因（如“鸟枪法”）人工合成基因反转录法化学合成法目的基因是人们所需要转移或改造的基因。如苏云金芽孢杆菌的抗虫基因，还有植物的抗病（抗病毒、抗细菌）基因、种子贮藏蛋白的基因，以及人的胰岛素基因、干扰素基因等。三种目的基因提取方法的优缺点仅限于合成核苷酸对较少的简单基因专一性

最强化学

合成法操作过程麻烦，mRNA很不稳定，要求的技术条件较高专一性强反转录法工作量大，盲目，分离出来的有时并非一个基因操作简便广泛使用鸟枪法缺点优点目的基因与运载体结合将目的基因导入受体细胞目的基因的检测和表达

检测：通过检测标记基因的有无来判断目的基因是否导入。表达：通过特定性状的产生与否来确定目的基因是否表达。常用的受体细胞有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。利用PCR技术扩增目的基因原理:DNA双链复制前提:要有一段已知目的基因的脱氧核苷酸序列，以便合成引物。(二)利用PCR技术扩增目的基因①概念：PCR全称为_______________，是一项在生物____复制___________的核酸合成技术③条件：_______________________、

_______________、___________、___________.前提条件：②原理：__________④方式：以_____方式扩增，即____（n为扩增循环的次数）⑤结果：选修1P60聚合酶链式反应体外特定DNA片段DNA复制已知基因的核苷酸序列四种脱氧核苷酸一对引物DNA聚合酶指数2n使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增(二)利用PCR技术扩增目的基因⑥过程：a、DNA变性（90℃-95℃）：双链DNA模板在热作用下，_____断裂，形成___________b、退火（复性55℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，从引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补的________。氢键单链DNA双链DNA链二:构建表达载体表达载体的组成目的基因启动子终止子标记基因1、将目的基因导入植物细胞的方法：农杆菌转化法（1）农杆菌介绍：（2）原理及适用范围(双子叶和裸子植物)(三)将目的基因导入受体细胞基因枪(单子叶植物),花粉管道法(转基因抗虫棉)2、将目的基因导入动物细胞（1）方法：显微注射法（2）程序：(三)将目的基因导入受体细胞3、将目的基因导入微生物细胞（1）原核生物特点：繁殖快、单细胞、遗传物质少（2）方法：

目的基因表达载体提纯取卵（受精卵）显微注射受精卵新性状动物用Ca2+处理细胞感受态细胞表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA分子(四)目的基因的检测与鉴定——检查是否成功检测—鉴定——①检测转基因生物染色体的DNA

上是否插入了目的基因②检测目的基因是否转录出了mRNA③检测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等方法——方法——方法——DNA分子杂交分子杂交（注意与上不同之处）抗原抗体杂交基因工程的成果与发展前景基因工程与医药卫生生产基因工程药品用于基因诊断与基因治疗基因工程与农牧业、食品工业培育高产、稳产和具有优良品质的动植物新品种培育具有各种抗逆性的动植物新品种为人类开辟新的食物来源基因工程与环境保护用于环境监测用于被污染环境的净化基因工程在的应用：1）高产、稳产和具优良品质的品种用基因工程的方法可以改善粮食作物的蛋白质含量。如“转基因高赖氨酸玉米”植株。2）抗逆性品种将细菌的抗虫、抗病毒、抗除草剂、抗盐碱、抗干旱、抗高温等抗性基因转移到作物体内，将从根本上改变作物的特性。如转基因抗虫棉。农业上2、转基因动物—乳汁中含有人生长激素的转基因牛(阿根廷)用于提高动物生长速度2、转基因动物—用于改善畜产品的品质例如将

导入奶牛基因组，使转基因牛分泌的乳汁中乳糖的含量大大

。乳糖酶基因减低基因工程与医药卫生我国生产的部分基因

工程疫苗和药物1、基因工程药品的生产微生物生长迅速，容易控制，适于大规模工业化生产。如利用大肠杆菌生产胰岛素、干扰素、白细胞介素—2等。既增加产量，又