放射免疫-荧光标记免疫

现代免疫分析技术---放射免疫与荧光免疫免疫分析技术的发展多元免疫技术免疫沉淀免疫凝集补体结合反应中和反应免疫标记技术经典免疫学方法化学发光胶体金酶免疫免疫荧光放射免疫PCR-免疫分析时间分辨荧光分析免疫标记技术=抗原抗体反应示踪物标记灵敏度特异性免疫标记技术的主要特点：高特异性、高灵敏度免疫技术+标记技术检测方法检测范围生化、常规免疫mg~μg（10-3~10-6g）荧光免疫、酶免疫μg~ng（10-6~10-9g）放射免疫、发光免疫ng~pg（10-9~10-12g）PCRpg~fg（10-12~10-15g）标记技术：将可被探测的示踪物质用化学方法与化合物连接。免疫技术：以抗原-抗体反应原理为基础，对样品中相应抗原或抗体进行检测。标记免疫分析：是利用多种标记技术与免疫技术相结合而建立的测定技术体系。其核心即是高灵敏性和高度特异性的有机结合。标记免疫技术－基本概念常见免疫标记技术放射免疫技术荧光免疫技术酶免疫技术

放射免疫技术

1959年，美国，Yalow和Berson测定血清胰岛素含量（标记抗原）1977年获诺贝尔医学奖

放射免疫分析技术

（Radioimmunoassay，RIA）

优点：特异性强，灵敏度高，结果准确，检样用量少，结果重复性好，操作易自动化；缺点：对抗体质量要求高，有放射性危害，检测仪器价格较高放射免疫技术分类1.放射免疫分析(radioimmunoassay,RIA)

以标记抗原与反应系统中未标记抗原竞争结合特异性抗体来测定待检样品中抗原量。2.免疫放射分析(immunoradiometricassay,IRMA)

以过量标记抗体与抗原非竞争结合，采用固相免疫吸附载体分离游离和结合标记抗体。3.其他：

放射受体分析(radioreceptorassay,RRA)放射配体结合分析(radioligandbindingassay,RBA)

Ag

Ab

*Ag

Ag-Ab

++标记抗原（F）特异性抗体被检抗原非标记抗原抗体复合物标记抗原抗体复合物（B）

*Ag-Ablimited,competitive

1.1放射免疫分析（RIA）技术原理抗原标准品与待测抗原结构---完全相同/结构相似且亲和力相近纯度---纯度90%以上（免疫纯）

较高的放射比放射性同位素特异性抗体

特异性高、亲和力高（Ka）、效价高

。“三高”！

1.2放射免疫技术基本条件标记核素125I

3H射线γβ理化性活泼差核素丰度>90%－半衰期

60.2d12.3y标记方法简单复杂标记设备低廉(γ计数仪)昂贵(β液闪仪)测量条件简单

复杂氯胺-T法：最常用的125I标记法，125I与酪氨酸共价结方法简便，但易造成蛋白质的损伤乳过氧化酶法（LPO）：标记方法更温和，对被标记物的生物活性影响125I-标记物的制备125I-标记物的纯化Sephadex层析，硅胶G薄板层析，HPLC分离125I-标记物的鉴定比放射性：单位化学量标记物中所含的放射性强度;免疫活性：与过量抗体反应的百分比越大，标记物免疫活性越好游离抗原与免疫复合物的分离第二抗体沉淀法

PEG沉淀法PR试剂法活性炭吸附法分离彻底，迅速分离试剂和过程不影响反应平衡效果不受反应介质影响操作应简单、重复性好经济测量、数据处理晶体闪烁计数器包括了NaI闪烁晶体、光电倍增管以及计数器测量的放射性信号是仪器输出的电脉冲数：每分钟计数(cpm)

计算

参数cpmB/T(%)F/T(%)B/F(%)B/B0(%)拟合注：T即是B（标记的复合物）与F（标记抗原）的总和

Ag*AbAg

标记抗原特异性抗体待测抗原(Ag*-Ab)+(Ag-Ab)抗原抗体复合物分离Ag*-Ab和游离Ag*从标准曲线上读知含量

测定Ag*-Ab和游离Ag*放射性

放射免疫测定法(RIA)示意图

1.3放射免疫技术基本类型液相法平衡法（一步法）顺序加样法固相法免疫放射分析技术

（immunoradiometricassay，IRMA）1968年，Miles和Hales应用同位素标记胰岛素抗体，成功检测牛血清中的胰岛素。Type

IRMARIA被标记物质抗体抗原抗体用量过量限量被检抗原相对分子量相对较大相对较小反应方式分步结合竞争结合B、F分离方法固相洗涤分离液相沉淀/吸附分离2.1免疫放射技术基本条件标记抗体的制备

抗体亲和力要求不高固相抗原免疫吸附剂

对抗原吸附力强，对非特异性蛋白吸附少，结合过程中高度分散（重氮化纤维素，琼脂糖4B珠）2.2免疫放射技术基本类型

经典IRMA）双抗夹心法2.2免疫放射技术基本类型放射免疫分析技术的灵敏度高、特异性强、精密度好,常用于各种激素、微量蛋白质、肿瘤标志物和药物等微量物质的测定。但由于放射污染和危害，常用核素半衰期短，试剂盒稳定期不长等诸多不足,RIA将逐渐被取代。放射免疫分析技术的应用荧光免疫技术Immunofluorescencetechnique，IFAIntroduction:1958年，Riggs等合成了异硫氰酸荧光黄（fluorescentisothiocyanate，FITC）；Marshall对荧光标记方法进行了改进，荧光技术逐渐推广1942年，Coons等，异硫氰酸荧光素标记抗体，检测小鼠组织切片中可溶性肺炎链球菌多糖抗原IFA荧光素敏感可测抗原抗体反应特异性显微技术高度精确优点：特异性强，敏感性高，速度快，结果直观---病原微生物缺点：荧光标本保存难（淬灭）非特异性染色荧光素具有共轭双键体系的化学结构通常处于最低能量状态---基态激发光（紫外光）照射，跃迁到激发态回到基态，释放光子能量（波长较长的可见光---荧光）

荧光免疫分析（IFA）技术原理

荧光免疫分析（IFA）技术原理YYY

一种有机或无机化学物质，其接受激发光后，能够以发射光形式产生明亮的荧光而作为染料使用。

各种荧光素都有各自的激发波长和发射波长。因发射波长不同而颜色不同。

异硫氰酸荧光黄（FITC），四乙基罗丹明（Rb200），藻红蛋白（PE）。

荧光免疫分析（IFA）基本条件

1.荧光素较高较稳定的荧光效率具有能与蛋白质分子形成稳定共价键的化学基团与蛋白质结合简单快速结合产物的荧光颜色与实验对象的自发荧光对比鲜明结合物具有一定的耐贮藏性

标记用荧光素应具备的条件抗体：特异性强、效价高、标记后活性高标记前：梅花状双扩测效价标记抗体种类：多克隆抗体、单克隆抗体、葡萄球菌A蛋白（荧光二抗通用试剂）

2.待标记抗体1mg/mLFITC（异硫氰酸荧光黄）标记抗体

Marsshall法

原理当FITC在碱性溶液中与抗体反应时，主要是抗体分子上的赖氨酸-氨基与FITC上硫碳胺键结合，一个IgG分子中有86个赖氨酸残基，一般最多能结合15～20个。

3.荧光标记抗体制备与纯化

荧光素-FITC-N＝C＋N-蛋白质FITC-N–C–N-蛋白质

‖‖SHHHSH

操作流程抗体的准备：20mg/ml(抗体+生理盐水+碳酸盐缓冲液）

碳酸盐缓冲液为总量的1/10。荧光素的准备：根据欲标记的蛋白总量，每毫克加入0.01mgFITC

（抗体与荧光素比例为50-100:1）标记：边搅拌边将称取的荧光素加入抗体溶液中（5-10min)。避免粘于瓶壁或搅拌棒上，继续搅拌12-18h，4℃透析：离心去沉淀，装入透析袋pH8.0缓冲盐水透析过夜，0-4℃过柱：葡萄糖凝胶G50或G25柱分离游离荧光素保存：4℃-40℃等量甘油分装保存。

3.荧光标记抗体制备与纯化

4.荧光标记抗体鉴定1特异性染色效价测定--与相应抗原标本染色2非特异性染色测定--与相类似抗原标本染色3吸收试验---在荧光抗体中加入过量抗原，吸收后再用相应抗原阳性标本染色，结果无明显阳性荧光。4F/P比值的测定方法F（荧光素）和P（抗体蛋白）的克分子比值反映荧光抗体的特异性染色质量，

F/P=1-2，过高------非特异染色增强；过低------荧光很弱，降低敏感性。

经典荧光抗体染色法流式细胞仪（FlowCytometor,FCM），以荧光免疫技术为基础发展起